第二节 噬菌体或病毒DNA

1. 第二节 噬菌体或病毒DNA Bacteriophage(phage) 是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的“寄生虫”。 组成：蛋白质、核酸. 结构：蛋白质外壳、尾巴 尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。

2. （一） λ-噬菌体的生物学特性 一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱 48.5kb （1）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链（粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。 • λcos位点是噬菌体包装必需序列。

3. （2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因

5. 结构区：A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质 • λ噬菌体基因大致分为4个区： • 重组区：att（attachment）、int（intagrate） 及xis（excision） • 调控区：启动子、终止子和N、CI基因 • 裂解区：O-R基因

6. 3、感染周期（溶菌循环） • λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 • 晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体

7. 包装 E 头部包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，A蛋白切割cos位点。

8. 4、溶源状态的建立 噬菌体感染大肠杆菌后，DNA直接整合到宿主细胞染色体DNA上，并不裂解细胞，这种情况称为溶源状态。 整合主要由cI和int基因的产物所激活，这两个基因的开放 与关闭取决于宿主细胞本身的性质。 cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。 • DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。

9. λ噬菌体DNA的整合与删除： • 噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体。 • 适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。 • 超感染免疫性 溶源性细菌，由于含有原噬菌体，故不能再 次被同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种 抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性。

10. 噬菌体的溶源和裂解

11. （二） λ-DNA载体的构建 1、缩短长度 野生型:上限51kb λ-DNA：48.5kb，外源基因2.5kb λ-DNA上有40-50%的DNA是复制，裂解所不必需的，切除便提高装载量。 左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb 右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。 中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。 • 根据切除的多少，将λ-DNA分为两大类载体： 插入型载体、取代型载体

13. 插入型载体（insertion vector） λgt10，可以携带8kb的DNA分子，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。 λZAPII，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通过lacZ’基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。 必须携带标记基因 经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入片段最大为14kb.

14. 取代型载体（substitution vector） 该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saλI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.

15. 1) Charon 系列 设计克隆外源 DNA 大片段的 取代型载体 2) EMBL 系列 设计克隆外源 DNA大片段 的 取代型载体。 优点：便于将外源DNA片段从重组体分子上切下。 3) 入-DASH 系列 含有 方向互为相反 的两套多 克隆位点接头序列， 优点: 便于多种 外源 DNA大片段的 取代重组。 4) 入-gt 系列 插入型表达 载体可用来克隆表达外源 c-DNA， 优点: 载体上温度敏感型阻遏物, 用来控制复制 及融合蛋白的表达。

16. 应用： • 插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。 • 替换型载体可承受较大分子量的外源 • DNA片段的插入，所以适用于克隆高等 • 真核生物的染色体DNA。

17. 2、酶切位点的删除或增加 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有 5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重 组操作，必须删除至1-2个. 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还 需要增加一些单一的酶切位点. 采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区内的酶识别序列使其失活。

18. 3、灭活某些与裂解周期有关的基因 将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因， 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖。 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。 • 基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。

19. 4、加装选择标记 野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加 装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容。 • 选择标记主要有两类： • 免疫功能类标记 • 颜色反应类标记

20. (1)免疫功能失活标记 (cI筛选) • 加装选择标记cI基因 • cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 • 含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成混浊斑； • 当外源DNA插入到标记基因中， 基因灭活， λ-重组分子便进入 溶菌循环，形成透明斑。

21. (2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选） • lacZ基因编码β-半乳 糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物； 而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。

22. 5、建立-噬菌体的体外包装系统 • 体外包装原理： • λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。 • 头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子； • 尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部和 尾部蛋白所需的蛋白因子。 将这两种突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。

23. 不具有琥珀型突变体校正功能的菌株 λDNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体

24. （三）λ-DNA作为载体的优点 • 可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒 的装载量 重组λ-DNA分子的筛选较为方便 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易. • λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，常用于 构建基因文库 • 缺点： • (1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高； • (2)没有质粒的用途广泛。

25. 二、柯斯质粒（cosmid） （一）柯斯质粒的构建 考斯质粒：一类人工构建 的含有λDNA两端cos序 列和质粒复制子的特殊类 型的载体。 组成：抗性标记、质粒复制起始部位、限制型内切酶切位点、cos粘性末端

26. （二）柯斯质粒的特点 1、具有λ噬菌体的特性。 具有cos位点，能像 λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。 2、具有质粒载体的持性。可以在受体细胞内 自由复制。 3、 具有高容量的克隆能力。可以装载比质粒或 λ-DNA大得多的外源DNA片段，40kb。 4、便于筛选：携带质粒的选择标记 。 5、便于克隆：有质粒上的多种单一酶切位点。 6、不能体内包装，不裂解受体细胞

27. 利用Cos质粒进行克隆 “柯斯克隆” （cosmid cloning）

28. 三、大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA （一）生物结构 外形呈丝状由外壳包装蛋白和 正链DNA组成；不裂解宿主细 胞，但抑制其生长。 DNA全长6407个核苷酸 约有10个基因

29. M13噬菌体的基因组 • 单链DNA，由6407碱基组成。 • 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 • 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。 • 编码3类蛋白质： ①复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ） ②形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ） ③结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）

30. θ复制 (二)感染周期

32. （三）M13 DNA载体的构建

33. M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点： ①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢； ②M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中； ③M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。

34. ⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。 ⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。

35. （四）M13DNA载体的特点 1、克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，在DNA定向突变中非常有用. 2、M13重组体筛选简便 可以利用菌落的蓝白斑筛选转染的转化子 3、制备的单链DNA、双链RF-DNAM13噬菌体，不经体外包装，可以转染大肠杆菌受体。 4、缺点：包装能力有限，仅包装克隆DNA为1.5kb。

36. 四、噬菌粒（phagemid or phasmid） 组成特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 • 像质粒那样在受体细胞中自主复制，克隆双链 DNA • 能像M13 DNA那样体外包装，并高效转染 受体细胞，制备单链DNA • 装载量比M13系列要大很多（10 kb） • 重组操作简便，筛选容易

37. 载体特点： • 含有一个质粒的复制起点，因此在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方法，复制形成大量的双链DNA分子； • 具有小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA片段，并易于进行体外分离与操作； • 编码有一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带着pUCll8或pUCll9噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨千青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择； • 拷贝数含量高，每个寄主细胞可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；

38. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA限制片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； • 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5′-端编码区，故可按照Xgal-IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组体分子； • lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因（当其读码结构没有发生改变的情况下）便会以融合蛋白质形式表达，即产生出β半乳糖管酶与外源蛋白质的融合产物； • 带有一个M13噬菌体的复制起点，所以在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中；

39. 五、人工染色体克隆载体（artificialchromosome vector） 利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 • 基本元件：含有质粒克隆载体所必需的第一受体（大肠杆菌）的质粒复制起始点； • 第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列. • 合适的选择标记基因。 酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（BAC）

40. （一）酵母人工染色体（YAC） 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装 在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。 含有的元件： 酵母4号染色体的复制起点和着丝粒序列 装载量为350-400kb 酵母系统的选择标记 质粒复制起点 质粒选择标记 四膜虫大核rDNA分子末端端粒重复序列

41. 克隆位点：位于sup4基因内 • SuP4是一个赭石突变（UAA）抑制基因。 • 宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade2。 • 在赭石突变宿主中，没有外源基因插入时，sup4基因抑制赭石突变，则形成正常白色菌落； • 有外源基因插入时，sup4基因遭破坏，则 形成红色菌落，十分容易挑选出有DNA插入片段的红色菌落，建成YAC文库。

42. 酵母人工染色体的使用

43. 酵母人工染色体（YAC）缺点 1、插入片段大，稳定性差 2、内部存在重组和嵌合现象 3、YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC 载体的广泛应用

44. （二）细菌人工染色体（BAC） 在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的， 在大肠杆菌受体菌维持单一拷贝，装载量范围 在50-300kb之间。 用于：克隆大型基因簇结构 构建动植物基因文库

45. Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.

46. （三）人工染色体克隆载体的应用 1、构建基因组文库 2、基因治疗 3、基因功能鉴定

47. 练习题 1.列举质粒载体必须具备的基本特性。 2.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因 内有一Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克 隆，问（1）涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的 菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选 到含有插入片段的重组体? 3.YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大 片段时，YAC具有优越性? 4.如何将野生型的λ-噬菌体改造成为一个理想的载体? 5.什么是蓝白斑筛选法和c I 筛选法?