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Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA. Biochimie appliquée. II- Biochimie des substances d’origine animale (2) . Préparé par: Mr. HALLA Noureddine. Culture de cellules animales (eucaryotes): L'hybridation cellulaire - application à la production d'anticorps monoclonaux.

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Presentation Transcript
slide1

Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA

Biochimie appliquée

II- Biochimie des substances d’origine animale (2)

Préparé par:

Mr. HALLA Noureddine

slide2

Culture de cellules animales (eucaryotes):

  • L'hybridation cellulaire - application à la production d'anticorps monoclonaux
slide3

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Introduction

Antigène

Protéine

Anticorps

slide4

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Introduction

  • Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène
  • assurant sa destruction.

Utilisation en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique.

slide5

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Historique

Georges Köhler et César Milstein:

la technique d’obtention des anticorps monoclonaux

1975

Ac monoclonaux chimériques souris/homme

1984

1986

premier Ac monoclonal mis sur le marché: Muromomab (anti-CD3)

Ac monoclonaux humanisés

1989

production d’Ac monoclonaux humains par des souris transgéniques ou transchromosomiques

1994

Plusieurs progressions

Présent

slide6

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Définition

Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont identiques car produits par un clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes).

Ils reconnaissent un type unique de site antigénique,

Ils sont homogènes contrairement aux anticorps polyclonaux.

Ils sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic et dans des buts thérapeutiques.

slide7

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Rappel

Lorsque les immunoglobulines lient une molécule ou une particule virale ou bactérienne, les immunoglobulines sont toutes désignées sous le nom d’anticorps, et l’entité reconnue est appelée antigène.

Anticorps

Deux propriétés :

- capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands, et

- participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose, sécrétion d’amines …)

Caractérisation

L’Ac joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire :

- c’est le récepteur, à la surface des lymphocytes B ou en solution dans le sérum,

- c’est le transmetteur ou l’activateur de signaux physiologiques.

Rôles

slide9

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

Deux principales techniques sont utilisées dans la plupart des laboratoires producteurs des anticorps monoclonaux

La technique des hybridomes

la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV

slide10

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

Déroulement de la production des hybridomes

test

des

hybridomes

sélection

des

hybridomes

fusion

des

cellules

obtention

des cellules

production

des

hybridomes

isolement

des

hybridomes

slide11

+

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

1

  • Obtention des cellules

Utilisation de

cellules myélomateuses HGPRT

Immunisation de la souris

avec l’antigène étudié

Obtention des cellules immortelles

Obtention des lymphocytes spécifiques

Fusion

slide12

+

Par méthode chimique

Par méthode physique

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

2

Fusion des cellules

sélection

fusion des membranes

cellulaires avec poly éthylène glycol

fusion des membranes cellulaires

par électroporation

slide13

+

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

3

Sélection des hybridomes

Culture sur milieu HAT (HypoxanthineAminoptérineThymidine)

Cellule myélomateuse HGPRT-

Lymphocyte B

MORT CELLULAIRE

Impossibilité de se diviser

MORT CELLULAIRE

disparition après quelques divisions

HYBRIDOME SELECTIONNE

slide14

+

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

4

Isolement des hybridomes

Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré (transferts des puits de 0,3 à 2 ml, puis à des bouteilles de 25 ml), les conserver et les cloner. Deux méthodes sont utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule :

slide15

+

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

4

Isolement des hybridomes

Sur milieu gélosé

Par dilution limite

Une colonie = une cellule initiale

Une ou zéro cellules par puit

slide16

+

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

5

Test des hybridomes

Test sur le surnageant de chaque puits

de la présence des anticorps monoclonaux par la méthode ELISA

du type d’anticorps produit par des méthodes d’immunoprécipitation

slide17

+

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

6

Production des ACM

Production par

cultures cellulaires

Amplification des hybridomes

obtention des anticorps monoclonaux

Production dans

les liquides d'ascites

Conservation des hybridomes

slide18

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

La technique des hybridomes

AMP

HGPRT

Hypoxanthine

IMP

Azasérine

GMP

Aminoptérine

Synthèse

endogène

Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine

Milieu Haza : Hypoxanthine, azasérine

Aminoptérine

Thymidine

TMP

Thymidine Kinase

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Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV

Il s’agit de transformer et de rendre cancéreux un lymphocyte humain sécréteur d’un anticorps donné en y introduisant le virus d’Epstein-Barr EBV.

L’EBV possède la propriété remarquable d’induire la prolifération continue des lymphocytes B infectés.

slide20

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV

Le virus est un membre de la famille des herpès virus. Il infecte 90 % à 95 % des adultes.

Il est responsable de la mononucléose infectieuse et du lymphome de Burkitt.

slide21

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Production

la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV

Les lymphocytes sécréteurs d’un anticorps obtenus chez un sujet immunisé suite à une infection ou à une transfusion, sont séparés des autres éléments figurés du sang sur gradient de densité 1.077.

Ils sont ensuite incubés en présence du virus selon différents protocoles.

slide22

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Applications

Ils sont utilisés pour la détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus, pour les groupages tissulaires HLA et pour l’immunomarquage des leucémies aigues.

la compréhension de nombreux processus biologiques.

Pour distinguer plusieurs sous-populations lymphocytaires.

la protéomique et les tests de dépistage biologiques en masse.

D’une façon générale, les anticorps monoclonaux sont utilisés en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique.

Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction.