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普析通用. 紫外/可见分光光度计. 技术讲座. 中南大学现代分析测试中心 邓世林. 内容提要 第一篇 原理及应用领域 第二篇 常用测定方法 第三篇 影响仪器质量的几个重要指标. 第一篇 紫外/可见 分光光度计的原理及应用领域.
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普析通用 紫外/可见分光光度计 技术讲座 中南大学现代分析测试中心 邓世林
内容提要 第一篇 原理及应用领域第二篇 常用测定方法 第三篇 影响仪器质量的几个重要指标
第一篇紫外/可见分光光度计的原理及应用领域第一篇紫外/可见分光光度计的原理及应用领域
光的选择吸收当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。 物质呈现出特征的颜色，就是它们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的缘故。 一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收
物质颜色和吸收光颜色的关系吸 收 光物质颜色 颜 色 波 长(nm)黄 绿 紫 400 ~ 450 黄 蓝 450 ~ 480 橙 绿 蓝 480 ~ 490 红 蓝 绿 490 ~ 500 紫 红 绿 500 ~ 560 紫 黄 绿 560 ~ 580 蓝 黄 580 ~ 600 绿 蓝 绿 600 ~ 650 蓝 绿 红 650 ~ 750
电磁波谱图 0.01nm 0.1nm 800nm 10µm 500µm 1cm 波长 200nm 400nm 2.5µm 25µm 1m 光谱 可区域 见γ 射线 χ 射线 紫外光 光 红外光 微波 无线电波分析 分光方法 χ 射线 光度 核磁共振γ 射线光谱法 光谱法 紫外光谱法 法 红外光谱法 微波光谱法 光谱法 1m = 104µm = 106nm = 109Ǻ
入射光 I0 透射光 I 光源 光程长 I0 透射率T = I UV/VIS/NIR 光照射到物质上 检测器
紫外/可见分光光度计的简单原理： • 朗伯定律（1760年）：物质对光的吸收与物质厚度成正比:A=f(b) • 比耳定律（1852年）：物质对光的吸收与物质浓度成正比:A=f(c)
1 吸收A = log = eC l T LAMBERT-BEER定律 当一束平行的单色光通过某一均匀溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的长度的乘积成正比。 成立条件：①单色光 ②稀溶液 此处 T : 透射率 e : 摩尔消光系数 l : 光程长 C : 浓度
1 A = log — = - log T = eC l = abc吸光度、透过率与浓度的关系（波长、吸收池光程一定） T %T 浓度
应用领域： 涉及化学化工、医疗卫生、冶金地质、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生产中的质量控制、原材料和产品检验等各个方面，进行定性分析、定量测定、纯度检查、结构分析、络合物组成及稳定常数测定、动力学研究等等。 目前，紫外可见分光光度计已成为全世界历史最优久、使用最多、覆盖面最广的常规分析仪器。
测定范围： 几乎所有的无机元素和在紫外及可见光区有特征吸收的有机物或有机化合物都能用紫外/可见分光光度法进行测定。
紫外/可见分光光度计的基本结构光源单色器样品室检测器 控制放大电路 显示器比色皿 光电管（或光电池） 放大器单色光 显示器单光束紫外/可见分光光度计 斩光器单色光 光电管（或光电池） 放大器反光镜双光束紫外/可见分光光度计
比色皿 光电管（或光电池） 斩光器 放大器单色光显示器光电管（或光电池）准双光束紫外/可见分光光度计S1准直镜切尼尔-特纳G单色器结构S2准直镜
（一）定量分析一、绝对法基于朗伯-比尔定律A = ebC，当某一物质在一定波长下e（吸收系数，可由已知浓度样品通过测量、计算求得）为一常数，比色皿的光程也是已知，也是一个常数，只要在吸收系数指定的波长处测定样品溶液的吸光度值(OD值)，然后由下式求得该样品溶液的浓度或含量：C= A /eb二、标准对照法在同样条件下，在选定的波长处，分别测定已知浓度标准溶液的吸光度值A标和样品溶液的吸光度值A样，然后由下式求得样品溶液的浓度或含量：C样 = A样 A标 C标
三、标准曲线法（包括K因数法）最常用的定量分析方法。即在一定波长（λmax）下测定某物质的标准系列溶液的吸光度作校正曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由校正曲线求得样品溶液的浓度或含量。 所配置的标准系列溶液的吸光度应在0.11.5Abs范围内，吸收测定的精密度可达0.5%。注意：UV/Vis的最低检测浓度与吸收系数、仪器噪声、基线平直度、光谱带宽有关。而最高检测浓度则与吸收系数、仪器的杂散光、光谱带宽等有关，吸收系数与光谱带宽有关。杂散光越小，检测上限越高。
如：核酸（DNA、RNA）的测定(260nm,280nm或230nm,260nm, 280nm)也是双波长或三波长测定法。五、多波长法六、多波长多组分定量法七、导数光谱法 导数光谱法由于能提高方法的灵敏度，改善方法选择性，有效的消除基体干扰，尤其适合浑浊试样和进行多组分同时测定。八、 化学计量学光度法 人工神经网络-分光光度法 模糊聚类-偏最小二乘光度法 小波变换-偏最小二乘法九、固相光度法 固相光度法是将有色络合物吸附或萃取在固相（如树脂，泡沫塑料，结晶萘，石蜡等）离子交换树脂上，再在固相进行光度测定。固相光度法是集分离、富集、测试于一体，不仅简化了试验过程，也大大提高了灵敏度和选择性。 另外，还有比吸收系数法、示差分光光度法等，因常规测定应用较少，这里不作详细讨论。
十、动力学光度法即时间扫描方式测定。是光度计的吸光度（Abs）、透过率（%T）随时间变化的一种动态测量方式。 主要用于酶机理研究、酶活性测定、元素分析及化学反应机理的研究等。动力学光度法因其特有的高灵敏度在光度分析中占有重要地位。动力学光度法可分为三种类型：（1）催化动力学光度法，这是最主要的也是最常用的动力学光度法，系利用被测离子催化显色体系的显色反应或褪色反应进行测定，近年来，利用催化反应测定的论文呈现非常明显的上升之势。其测定范围已包括许多过渡金属、贵金属、非金属和无机阴离子。涉及的元素有Ag、Al、AS、Au、Bi、Br、Ca、Cd、Ce、Co、Cr、Cu、Eu、F、Fe、Hg、I、Mn、Mo、Ni、Os、Pb、Pt、Pd、Re、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Sr、Te、Ti、Tl、Th、U、V、Zn等。涉及的阴离子有SCN-、BrO3-、NO2-、NO3-。（2）诱导动力学光度法，系利用某一转化反应来诱导另一转化反应，借以进行光度测定。（3）速差动力学光度法，是利用性质相近的不同离子在同一显色体系中反应速率常数的差异，对其分别进行光度测定。
ABS ABS (%T) (%T) 时间 时间
（二）定性分析一、利用标准物质定性在相同条件下，用光谱扫描法测定未知物的吸收光谱，与所推断化合物的标准物的吸收光谱进行比较，如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点等完全一致，就可初步判定未知物与标准物是同一种物质。但要注意，物质不同但光谱相似的特殊情况。二、用波长位置判断有机化合物的生色基团 例如，若发现在210∼250nm有强吸收峰，则可能有双键并处在共扼状态。在260nm、300nm、330nm有高强度的吸收带，表示有3∼5个共扼单位，如在270∼300nm之间有弱吸收(e=10∼100)，表示有羟基的存在；在250∼300nm之间有中强度吸收(e=1000 ∼10000)，表示有笨环存在等。
（三）纯度检查主要用于检查对光没有特征吸收的化合物中的具有特征吸收的杂质。如检查乙醇中醛的量，可用蒸馏水作参比，在270∼290nm处测量吸光度，如在280nm处有吸收，表示有醛。双波长或三波长核酸（DNA、RNA）的测定时，根据A260 / A280的比值可确定DNA或RNA的纯度。对于DNA，比值为1.6 ∼1.8之间,RNA比值为1.8 ∼2.0之间,认为纯度较高。 又如四氯化碳中，最主要的杂质是二硫化碳（CS2）。二硫化碳杂质的多少，衡量产品质量的好坏。二硫化碳在紫外区的318nm处有一个很强的吸收峰。因此，只要检查318nm处二硫化碳吸收峰的大小，就可知道四氯化碳产品是否合格。
（四）固体样品的分析固体样品分析的配件主要有：积分球、镜面反射装置、固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架等。 积分球是利用固体样品的正反射（入射光按以法线为中心的对称角度反射，称镜面反射）或漫反射（入射光向各方向反射）的特性进行分析的装置。 镜面反射装置主要用于半导体、光学材料的反射率测试。 固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架用于光学玻璃、电泳胶条等的测定。 积分球、镜面反射装置是利用光的反射原理进行定性、定量测定。如配备有透射样品池架，也可进行样品溶液的透射测定。如配备大内径积分球（Φ150mm）可测定粉状、纸、布料及溶液等样品的反射透射光谱，同时最适合于色彩分析。参比光束I0倒置型 标准白板 光电倍增管 样品样品光束 积分球示意图
（五）结构分析紫外/可见分光光度计可用来判别物质的异构体，如互变异构体、顺反异构体等。（五）结构分析紫外/可见分光光度计可用来判别物质的异构体，如互变异构体、顺反异构体等。
一、光度准确度与重复性定义：多次测量平均值与真值之差为光度准确度（ΔT 、Δ A）；最大值与最小值之差为光度重复性。偏差越小，准确度越高。光度准确度和光度重复性是非常重要的技术指标，直接关系到测试结果的准确性。 光度准确度在不同的吸光度范围是不同的，因此光度准确度的表示一定要指出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试的。影响光度准确度的主要因素有：① 仪器的杂散光大小。 ④ 仪器的光谱带宽 ② 仪器的光度噪声 ⑤ 试样的制备 ③ 仪器的基线平直度 ⑥ 比色皿的性能光度准确度的检查:一般用标准滤色片或的重铬酸钾的0.005mol/L H2SO4溶液。酸性重铬酸钾溶液的标准吸收值如下：吸 光 度 测量波长(nm) 溶液A (50mg/L K2Cr2O7) 溶液B (100mg/L K2Cr2O7) 235（谷） 0.626 ± 0.09 1.251 ± 0.019 257（峰） 0.727 ± 0.007 1.454 ± 0.015 313（谷） 0.244 ± 0.004 0.488 ± 0.007 350（峰） 0.536 ± 0.005 1.071 ± 0.011
光度准确度与吸光度相对误差和吸光度真值的关系光度准确度与吸光度相对误差和吸光度真值的关系
二、杂散光定义：单色器额定通带以外的透射辐射能量与总的透射能量之比，也就是光谱通带以外“不要的”光通量就是杂散光。杂散光是一个非常重要的关键技术指标，它是紫外/可见分光光度计分析误差的主要来源，直接限制被分析测试样品的上限。当仪器的杂散光一定时，被分析样品的浓度越大，其分析误差就越大。杂散光的主要来源： 1、灰尘沾污光学元件。2、光学元件被损伤。 3、准直系统内部或有关隔板边缘的反射。 4、光学系统屏蔽不好。 5、热辐射或荧光引起的二次电子反射。 6、狭逢的缺陷。 7、光学系统的像差。、 8、单色器内壁黑化处理不当。 光栅是杂散光的主要来源，占总杂散光的80%。测定方法：一般采用标准滤光片或10g/L的NaI及NaNO3水溶液。在紫外区测定220nm(NaI)或340nm(NaNO3)处的透过率%T ，在可见光区用384mg/L的KMnO4 ，测定525nm处的透过率%T 。
举例： • 比如对某生物酶检测：假设测定的吸光度为1.95Abs,要求达到1%误差；仪器的杂散光为0.2%，行不行？ • 不行！为什么？因其误差为3.6%！只有当仪器的杂散光为0.05%,才可达1%! 见前图。
不同程度杂散光对比尔定律的偏离 0.1%T
三、噪声定义： 无样品时仪器自身的波动。 也就是说：噪声是叠加在待测量的分析信号中不需要的信号，即零信号上下波动的振幅宽度。重要性：光度噪声影响光度测量的灵敏度（信噪比）、精密度和准确度。限制测定浓度的下限，是分析误差的主要来源。主要来源：光学系统、光源、检测器、电子元器件及电路设计等。 噪声的测定：在时间扫描方式下，于500nm波长处连续测量120秒钟，由所记录的吸光度—时间光谱图量出峰——峰值即为仪器的噪声。改变仪器的响应时间可改善信噪比。
四、稳定性定义：是指不放置样品情况下，零吸收读数在一定时间内偏离的程度（1小时内仪器自身的漂移量）。影响稳定性的主要因素：光源（氘灯：电源1%-光6.7%；钨灯：电源1%-光3.4% ） 光电倍增管(电源1%-放大后的信号12% ) 温度、环境等重要性：同样是分析误差的主要来源。影响测定的重现性与准确度，严重甚至根本无法测定。测定方法： 在时间扫描方式下，仪器预热2h，于500nm波长处连续测量1小时，由所记录的吸光度—时间光谱图曲线的峰—峰值检查仪器的稳定性。
五、基线平直度定义： 基线平直度是指不放置样品情况下，全波段扫描（需先进行全波段范围基线校正），基线倾斜或弯曲的程度以及各个波长点的光度噪声（P-P）。 原因： 光学系统失调； 参比光束与样品光束不平衡； 仪器受震、光源位置改变。 重要性： 它是各个波长上主要分析误差的来源之一，平直度不好使样品吸收光谱中各吸收峰之间的比值发生变化，给定性分析造成困难。
六、波长准确度与重复性 • 波长准确度：多次测量平均值与真值之差。 • 波长重复性：多次测量值中最大最小值之差。 波长重复性在扫描速度、分光带宽、吸光度一 致情况下主要体现为仪器机械重复性。 • 测定方法：用汞灯（546.07nm、253.65nm)、 氘灯(656.1nm、486.0nm) 或者用标准滤色片。 重复单向扫描三次，计算最大差值。 • 重要性：吸光度是随波长而变化的，波长准确度、重复性不 合格，何谈分析
七、 光谱带宽(SBW) • 定义：谱线的半宽度。 • SBW不等于狭缝宽度，关系如下： SBW=d（λ/mm)×b（mm) b---狭缝宽度，以mm计。d(λ/mm)---倒线色散率。 • SBW的重要性：影响光度准确度和分辨率。 • 如何影响分析测试结果？见下图：
