亚砷酸盐刺激 NIH 3T3 细胞 HSP27 转位的机制研究

1. 亚砷酸盐刺激NIH3T3细胞HSP27转位的机制研究 报告人：基础医学院04级医学实验技术--李涛 指导老师：姜勇教授、龚小卫博士

2. 知识背景 基本结构：热休克蛋白N端为一个具有ATP酶活性的高度保守序列和C端一个相对可变的基质识别序列。

3. 知识背景 HSP27在细胞应激中的作用

4. 知识背景 ?

5. 研究目的及意义 • 研究HSP27在受刺激后移位入核与p38的关系，明确p38在HSP27移位入核过程中的作用机制。 • 在研究基础上初步提出HSP27移位入核的分子机制。 • 此次研究为进一步研究p38在HSP27移位入核分子机制的作用奠定基础，对p38信号通路异常引起的一些疾病的临床治疗提供了一些新的思路。

6. 研究内容 • 验证HSP27在刺激作用下能移位入核 • 研究HSP27移位入核与p38的关系

7. 技术路线 NIH 3T3细胞 p38抑制剂SB203580预处理 EGFP-HSP27(WT) EGFP-HSP27(S82A) EGFP-C2 空白 对HSP27功能无影响 对HSP27细胞内定位影响 对HSP27磷酸化影响

8. 实验流程 1.定点突变、载体构建 2.细胞培养、预处理、刺激 3.脂质体介导的细胞转染 4.荧光显微镜观察 5.免疫印迹（Western blot）检测 6.实验结果分析

9. 实验结果 • HSP27的定点突变结果 —HSP27第82位丝氨酸定点突变为丙氨酸[AGC突变为GCC] Fig. 1 The sequencing of the HSP27(S82A) mutant The mutated sites were underlined

10. 实验结果 • EGFP-HSP27(WT)和EGFP-HSP27(S82A)的鉴定 Fig. 2 The construction and identification of EGFP-tagged HSP27(WT) and HSP27(S82A) A: 1, DNA ladder; 2, PCR product of EGFP-HSP27(WT); 3, PCR product of EGFP-HSP27(S82A). B: 1, DNA ladder; 2, EGFP-HSP27(WT) digested by Hind III and BamH I; 3, EGFP-HSP27(S82A) digested by Hind III and BamH I

11. 实验结果 • EGFP-HSP27(S82A)的移位被阻断 Fig. 3 Effect of Ser82 mutation on the nuclear translocation of HSP27 in the cells stimulated with arsenite (400)

12. 实验结果 • SB203580预处理阻断了HSP27的磷酸化 Fig. 4 Effect of SB203580 on the Ser82 phosphorylation of HSP27 in the cells stimulated with arsenite 1, control; 2, NaAsO2; 3, SB203580+NaAsO2

13. 实验结果 • SB203580预处理阻断了HSP27的移位入核 Fig. 5 Effect of SB203580 on the nuclear translocation of HSP27 in the cells stimulated with arsenite (400)

14. 小结 为研究HSP27的磷酸化激活与其细胞内定位之间的关系 EGFP-HSP27(WT) 和EGFP-HSP27(S82A)真核表达载体转染NIH3T3细胞 结果分析 p38 MAPK特异性抑制剂SB203580预处理NIH3T3细胞

15. 小结 • 野生型HSP27受到应激刺激后移位入核，而其突变体HSP27(S82A)不能入核 。 • SB203580的预处理使HSP27的磷酸化和移位入核都被阻断 。 • 以上说明p38 MAPK确实在HSP27磷酸化激活后的移位入核中起作用

16. 下一步工作 • HSP27另外两个磷酸化位点（Ser15和Ser78）被突变后对HSP27磷酸化及其移位入核的影响。 • 探讨HSP27的上游激酶MK2或PRAK在其移位入核中的作用 。 • HSP27移位入核后所介导的生理功能 。

18. Thank you！