第四章普通组织化学普通组织化学是指以常用的组织化学技术，对细胞内主要化学成分和活性的粗略（一般性）的研究。本章就几个经典实验概要介绍如下：

第四章普通组织化学 普通组织化学是指以常用的组织化学技术，对细胞内主要化学成分和活性的粗略（一般性）的研究。本章就几个经典实验概要介绍如下：

一、核酸（DNA和RNA） （一）化学特性 1．分布： DNA （细胞核内） RNA（核仁10% ；细胞质-核糖体90%） 2．分子结构：戊糖+ 磷酸+ 碱基特点：①大量的磷酸基团→酸性（嗜碱性的基础） ②戊糖—被盐酸水解→醛基（成为Feulgen法显示核酸的基础）

②戊糖—被盐酸水解→醛基（成为Feulgen法显示核酸的基础）②戊糖—被盐酸水解→醛基（成为Feulgen法显示核酸的基础） ③可以完全水解或部分水解 ④可以用RNAase或DNAase消化 [ 对照实验（—）]

（一）显示方法 1．福尔根（Feulgen）反应显示DNA [ 原理] 在60℃温度下，将DNA用1N盐酸水解，DNA双链打开成单链，先释出碱基，然后脱氧核糖释出醛基，该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀。

[ Schiff试剂显色原理] 碱性品红亚硫酸 → 白亚黄酸（无色试剂，称为Schiff试剂） [方法] 固定剂的选择可用一般的组织学固定液，常用Carnoy固定液。 Carnoy固定液：纯酒：氯仿：冰醋酸= 6：3：1 (60ml) (30ml) (10ml)

恒冷箱切片机的具体染色步骤如下： ⑴切片固定在冰醋酸与纯乙醇（1：3 V/V）中10分钟。 ⑵由乙醇降至蒸馏水中。 ⑶用1N盐酸浸泡。 ⑷放入预热到60℃的1N盐酸中，留6分钟。 ⑸放入室温的1N盐酸中。 ⑹放入Schiff液试剂，保持在暗处，60分钟 ⑺ 用新配制的SO2水浸洗3次（脱掉未反应的Schiff液）。

⑻蒸馏水浸洗净（必须用蒸馏水→洗净无色品红，⑻蒸馏水浸洗净（必须用蒸馏水→洗净无色品红，否则，残留试剂→有色品红）。 ⑼脱水透明、封固。结果：核内DNA染为红紫色。对照：仅改变第4步为1N盐酸，室温15分钟→（-）。 [ 注意事项] ⑴不用醛类固定剂如Bouin、戊二醛、丙烯醛等。常用Carnoy液、甲醇等。 ⑵控制水解时间，不同的固定剂用不同的时间，如：Carnoy 8分钟；Genker 5分钟； Susa 18分钟★最适条件应自行试验。 ⑶控制温度，一般1N盐酸60℃；如果5N盐酸18～25度。

⑷保证Schiff试剂的纯净度。 ⑸SO2要新配制，除去多余的Schiff液宜用之。 ⑹必须对照。 2．显示核酸的其它方法 ⑴Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法 ⑵甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和 RNA法 ⑶菊花青铬明矾（GC）显示核酸法 ⑷丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法 ⑸核酸提取法

一、蛋白质（Protein） （一）蛋白质的分子结构蛋白质的基本单位是氨基酸，肽键将不同的氨基酸结合在一起，除氨基和羧基之外，还含有其它基团，如：—羟基、硫氢基、二硫基等。依其结构特点可分为：酸性氨基酸和碱性氨基酸；芳香族氨基酸：苯丙氨基酸、酪氨基酸；杂环类氨基酸：组氨基酸、色氨基酸、亚氨基酸、脯氨基酸、羟脯氨基酸。

（二）目前应用 1．用于蛋白质的一般定性 ①确定是否为蛋白质 ②确定蛋白质的酸碱性 ③显示蛋白质的特殊基团 2．用于蛋白质功能定性和定位

（三）染色方法 目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶组织化学法、配体—受体结合法、免疫组化法以显示特殊的蛋白质。这里仅介绍一般的染色方法。 1．四氮化联邻茴香胺法（Tetra-azotized-o-anisidine） [ 应用] 广泛应用于显示酶的活性 [ 原理] 芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（＜ 5℃）可生成重氮盐，此即重氮反应。重氮盐可与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物。上述反应必须在酸性条件下进行。

本实验，联邻茴香胺在酸性、低温条件 下与亚硝酸作用生成四氮盐。四氮盐有两个重氮盐，其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸、色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应，另一个重氮基与酚类或奈类发生偶联反应以增色。因此，可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量。

[ 方法] 1．四氮盐配制 ⑴天平称取联邻茴香胺0.25g（有毒，通风橱内进行）。 ⑵在冰浴下，加入已预冷8%盐酸10ml，玻璃搅拌，促其溶解，混合后为悬浊液。 ⑶称NaNO2 0.15g溶于1ml蒸馏水中（冰浴下）。

⑷在冰浴下，将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内，每次倒入都须玻棒搅动，因产生NO2可有黄烟冒出，至黄烟停止再倒下一次液体。放入冰箱（4℃）内，约20分钟，待溶液变为黄色。⑷在冰浴下，将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内，每次倒入都须玻棒搅动，因产生NO2可有黄烟冒出，至黄烟停止再倒下一次液体。放入冰箱（4℃）内，约20分钟，待溶液变为黄色。 ⑸倾出上清液，勿将沉渣泛起，弃去沉渣。 ⑹用NaHCO3细粉（约0.5～0.6g）逐渐加入上清液内，边加边搅拌（冰浴下）。 ⑺以刚果红试纸测中和点，待试纸不变蓝即达到中和。收集于标本瓶（或广口瓶）内，置冰箱备用。此液不稳定，置冰箱内可保存两周，若变为橘红色则失效。

2．偶氮反应 —Carnoy固定的大鼠肝、肠等石蜡切片。 ⑴切片脱蜡至水。 ⑵将切片放入下列溶液中（在冰浴中至2～3℃），浸染10分钟。用前配制：四氮化联邻茴香胺溶液4ml 0.1巴比妥缓冲液（pH9.2）20ml 24ml ⑶入1N盐酸（冰浴中2～3℃）浸洗10秒，多余盐酸以滤纸吸干。

⑷入H酸饱和液，浸染30分钟（冰浴或冰 箱内）。 H酸饱和液配制：H酸0.4g 0.1M巴比妥缓冲液20ml （pH9.2）过滤后使用！ ⑸蒸馏水冲洗，脱水、透明、封固（树胶） [ 结果] 酪氨酸、组氨酸、色氨酸染成红棕色（+）

※0.1M巴比妥钠50ml配制 ① 分析天平称巴比妥钠（MW=206.18） 1.0309g ② 于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可。 0.1M巴比妥缓冲液，pH9.2（20ml）配制: 0.1M巴比妥钠 19.1ml 0.1N盐酸 0.9 ml 20 ml

2．其它的显示蛋白质的方法 ⑴ 米朗反应（Millon Reastion）→显示酪氨酸的方法酪氨酸→羟苯基亚硝酸 →亚硝基苯+Hg→有色物注：胶原蛋白不显色，其它蛋白质都显色（+） ⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene （DNFB）法 DNFB与—NH2、SH和酪氨酸产生弱有色反应，可被偶氮染料加强。

⑶ 酪氨酸重氮化偶联反应 ⑷ 蛋白质硫氢基DDD法（固定时避免氧化剂） ⑸ 铁—铁氰化钾反应显示SH基 ⑹ 高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法 ⑺ 免疫荧光法显示蛋白质

三、碳水化合物 中性多糖——糖原碳水化合物酸性多糖——硫酸软骨素 A、B、 C，肝素、硫酸角（组织中—多糖类）质素、透明质酸等蛋白多糖——粘蛋白、唾酸粘蛋白糖脂——脑苷脂类 ※ 组织中糖的种类较多，因此，要特异性地显示各种糖类必须用抑制和酶水解来对照实验。本章仅以高碘酸雪夫法（PAS法）说明之，其它的方法还有Alcian blue法，甲苯胺蓝异染性染色法等。

高碘酸雪夫法 Periodic—Schiff（PAS）method [ 原理 ] 高碘酸为强氧化剂，它可以氧化多糖分子内1，2—乙二醇（顺式和反式）而产生醛基，此醛基再与Schiff试剂结合即产生红紫色。 [ 方法 ] 改良的McManus（1946），高碘酸雪夫法标本： ① Carnoy固定的大白鼠肝、肾、肠石蜡切片 ② 大白鼠肝横冷箱切片（未固定）

[ 步骤 ] (1) 切片脱蜡入水（横冷箱切片免） (2) 入0.5%高碘酸水溶液，室温，2～5分钟 (3) 蒸馏水涮洗 (4) 入Schiff试剂，洗3次，每次2分钟 (5) 入SO2水中，洗3次，每次2分钟 (6) 自来水洗5～10分钟 (7) 蒸馏水稍洗 (8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟

（9）自来水5分钟，换蒸馏水 （10）脱水、透明、封固 [ 结果 ] PAS（+）→红紫色或红色；核→蓝色 Carnoy固定，糖原原位定位不佳，有移位现象。 [ 对照 ] ① 用唾液酸淀粉于37℃消化20～30分钟。 ② 苯甲酰或乙酰化法作对照（抑制法）

[ 注意事项 ] ①必须按照规定配方配制试剂，按规定的时间反应。以避免非特异反应。例如：入高碘酸水溶液时间不宜过长，否则非特异着色。 ②多糖大多都易溶于水，固定时应避免扩散或移位。冰冻切片+苦味酸福尔马林→固定→避免扩散或移位。 ③注意溶液的pH值：高碘酸液的pH不应超过5。 ④注意温度。反应宜在＜25℃的室温下进行，否则可氧化醛基为羧酸。

⑤高碘酸溶液的浓度宜控制在0.5%～1%（0.02—0.1M）浓度过高则会发生非特 异反应。 ⑥为充分显示多糖中的糖原，可在过碘酸中加入5%醋酸或纯乙醇固定，但往往有溶解和扩散。 ⑦为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应，可使用还原液，于使用Schiff液之前。 [ 分析结果 ] PAS反应阳性物质：糖原、中性粘蛋白、中性唾液性粘蛋白。

四、脂类 [ 组织中的脂类 ] 单纯脂类脂肪酸醇的化合物（如：甘油三脂等）复合脂类磷脂（卵磷脂，脑磷脂）脂类鞘磷脂糖脂（脑苷脂，神经苷脂）衍生脂类胆固醇肾上腺素性激素

[ 显示脂类的基本原理 ] 用易溶于脂类的染料，使之溶于所检的脂质（如脂滴）中，使组织内的脂类着色。 [ 常用方法 ] 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼罗蓝法 [ 基本要求 ] ⑴ 不用石蜡切片。 ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好。

⑶ 方法： ① 物理法：脂溶性染料，不溶于水，属偶氮染料。常用苏丹Ⅲ、Ⅳ，苏丹黑，油红O等。 ② 化学方法：硫酸尼罗蓝显示脂肪酸。 ③ 选择性提取法（对照）

实验举例：苏丹黑B法 [ 原理 ] 苏丹黑为偶氮染料，具有脂溶性，可溶于无水酒精，但不溶于水（常用70%酒精饱和液）。当组织切片入染液时，苏丹黑B便离开染液而溶于组织内的脂质（如脂滴中）使组织内脂类着色。标本：兔肾上腺和睾丸横冷箱切片，10μm厚，不固定（或用10%Formalin固定10分钟后水洗）。

[ 方法 ] ① 入蒸馏水洗 ② 于70%乙醇内涮洗 ③ 入苏丹黑B 70%B饱和液，染5～10分钟 ④ 于50%酒精内浸洗 ⑤ 蒸馏水中洗 ⑥ 入Mayer苏木精（复染细胞核）1分钟 ⑦ 自来水冲洗5～10分钟 ⑧ 入蒸馏水 ⑨ 甘油明胶（或Apathy糖胶）封固 [ 结果 ] 细胞内脂滴均呈黑色

第四章 普通组织化学 普通组织化学是指以常用的组织化学技术，对细胞内主要化学成分和活性的粗略（一般性）的研究。 本章就几个经典实验概要介绍如下：