Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles

1. Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles • - Transferts d'électrons en biologie • - Spectroscopie d'absorption cinétique • Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles • Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase : • - présentation • - transferts d’électron, mécanismes Pierre Sétif CEA Saclay DSV/iBiTec-S/SB2SM Laboratoire de Photocatalyse et Biohydrogène

2. D + A  D+ + A- Interaction des orbitales électroniques impliquées dans le transfert est faible : les réactants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique ("outer-sphere mechanism") Réactions chimiques (enzymatiques ou non) : les réactants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique ("inner-sphere mechanism")  En biologie : Distances centre à centre : 8 - 25 Å Distances bord à bord : 3 - 20 Å ("outer-sphere mechanism")

3. densité de probabilité (orbitale moléculaire) : Puits de potentiel : au sein d'une protéine transfert d'électron possible Les orbitales électroniques impliquées doivent se recouvrir énergie d'ionisation dans le vide D A distance Couplage électronique (faible) TDA

4. Lorsque l'électron passe du donneur à l'accepteur, les noyaux ne changent pas de position Approximation de Born-Oppenheimer, principe de Frank-Condon (transitions électroniques) : la transition est verticale Conservation de l'énergie : la transition est horizontale Tunneling de l’électron (D + A) (D + A) (D+ + A-) (D+ + A-) énergie potentielle x0 (D, A) x0 (D+, A-) xnoyaux (d, )

5. énergie de réorganisation  Gactivation (G ° + )2 Gactivation= 4  (D + A) (D+ + A-) G°

6. Constante de vitesse de transfert d'électron kTE (théorie semi-classique de Marcus) couplage électronique énergie d'activation 1 kTE = TDA2 exp 4   kBT terme nucléaire (facteur de Franck-Condon) FC 4 2 (G° + )2 - 4  kBT h G° : différence d'énergie libre entre l’état final (D+ A-) et l’état initial (D A)  : énergie de réorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 à 1.5 eV) T : température; kB : cte de Boltzmann; h : cte de Planck Conditions de validité : - faible couplage électronique TDA entre donneur et accepteur (d > 6-7 Å, dbord à bord > 3-4 Å) - transfert d'électron couplé à des vibrations de faible énergie : h < kBT (traitement classique) Marcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811, 265-322

7. (D + A) (D+ + A-)  Gactiv.= 0 Gactiv. G° (di,i) (G° + )2 1 - exp FC = 4  kBT 4   kBT (G ° + )2 Gactivation= 4    ((di,i)) = Cte TDA = Cte G° < 0 log (kET) région normale région inverse - G° 0

8. membrane Energie libre WT P865* Bpha  1012 s-1 G° (WT) = -0.2 eV P865+ Bpha- (bactériophéophytine a) h  108 s-1 G° (WT) = -1.2 eV (quinone)   0.3 eV P865 Bpha par rapport à WT P865* Bpha  P865+ Bpha- P865*(1er état singulet excité): réducteur très fort Haffa et al (2002) J. Phys. Chem. 106, 7376 Centre réactionnel bactérien (Rhodobacter sphaeroides)

10. Mélange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) : - Lorsque la diffusion des partenaires est cinétiquement limitante, la vitesse observée correspond à la vitesse de formation du complexe. A concentrations élevées, on peut éventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre étape limitante, correspond au transfert d'électron. - Limitation cinétique ( > 1-2 ms). Voltampérommétrie cyclique de protéines adsorbées sur l’électrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques Méthodes de mesure des vitesses de transfert d'électrons Mélange à l'équilibre D A  D+ A- : modifications de propriétés spectroscopiques liées au transfert d'électron. Ex. : en RMN, système partiellement réduit. En régime de mélange rapide de raies "ox" et "red" (kTE > ox - red), on observe un élargissement éch des nouvelles raies résultantes éch, dû au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/kTE = héch /kTE  h d'où éch  kTE Transfert d'électron déclenché par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cinétique, spectroscopies vibrationnelles, ...): - systèmes photobiologiques naturels : centres réactionnels photosynthétiques, photodissociation d’un ligand (hème-CO), photolyase, ... - adjonction ou modification d'un cofacteur "coloré" pour le rendre photochimiquement actif (durée de vie assez longue d'un état excité du cofacteur) : - complexes de Ruthénium adsorbés ou dans un complexe qui permet la liaison à la protéine. - porphyrines avec Zn ou Mg substitués à Fe. - flavines naturelles, associées à la protéine ou ajoutées dans le milieu.

11. I I0 Résolution temporelle quasi illimitée 0 t 0 Identification de la nature chimique des réactions grâce aux spectres d’absorption différentiels Spectroscopie d’absorption par éclairs Excitation détection/amplification/numérisation Echantillon Lumière d’analyse ΔA = - log (I/I0) ΔA 0 Mesures entre 250 et 1500 nm (transitions électroniques) 0 t

13. ATP et NADPH : assimilation du CO2 en sucres (cycle de Calvin) D'après Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones) (American Society of Plant Physiologists)

14. , puis séparation primaire de charges Transfert d'électron ( ) déclenché par la lumière : absorption par les chlorophylles, formation de l'état excité 1S de P700 - FB FA FX - A1 A'1 A0 A'0 P700 + h < 10 ps < 500 ns ferrédoxine (flavodoxine) FB FA agrégats [4Fe-4S] FX A1, A1' : phylloquinones A0, A0' : chlorophylles a P700 : dimère de chl. a photosystème I cytochrome c6 (plastocyanine)

15. FB FA FX A1 A'1 A0 A'0 P700 + P700 /P700* 1-3 ps -1.2 A , A' 0 0 -1.0 20 ps -0.8 15 ns/200 ns F A , A' X 1 1 F -0.6 B F A Fd -0.4 n (700 nm) = 1.77 eV h -0.2 0.0 0.2 P700 : dimère de chlorophylles a A , A' : chlorophylles a 0 0 A , A' : phylloquinones 0.4 1 1 F , F and F : agrégats 4Fe-4S + X A B P700 /P700 E (V) / H2 at pH 0) (ref.: H+ m

16. membrane Photosystème I de la cyanobactérie Synechococcus elongatus : structure à 2.5 Å 400 kDa Jordan et al. (2001) Nature 411, 909

17. Vue perpendiculaire à la membrane: tous cofacteurs chlorophylles : transfert d'électron transfert d'excitation ("antenne") Jordan et al. (2001) Nature 411, 909

18. Dans la plupart des réactions de transfert d’électron biologiques : G° est de faible valeur absolue, est souvent négatif mais parfois positif : -0.3 eV< G°< 0.3 eV   0.7 à 1 eV : région « normale » de Marcus Centres réactionnels photosynthétiques : - les premières étapes de transfert productif (séparation initiale, stabilisation) se déroulent à l’optimum: - G° = . Il s’agit d’une exception en biologie - les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que l’étape de transfert vers l’accepteur suivant: région inverse de Marcus (pour D+A- = P700+ Chla-)

19. éclair laser réactions de 1er ordre Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité : PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)-

20. éclair laser 2ème ordre Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité : PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)-

21. éclair laser 2ème ordre réactions de 1er ordre Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I Equilibre de liaison à l'obscurité : PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)-

22. Ferrédoxine (Fd) - Fd- (FA,FB) - (FA,FB)- (Fd, (FA,FB)-) - (Fd-, (FA,FB)) Synechocystis 6803 : 3 phases de 1er ordre à pH 8.0 : < 1 µs, 20 µs et 100 µs à 21°C

24. Ferrédoxine de cyanobactérie Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

25. Ferrédoxine de cyanobactérie résidus acides aspartique et acide glutamique : COO- résidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0 Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017

26. membrane

27. PsaE PsaC PsaD membrane

28. diminution d'affinité augmentation d'affinité Mutations des 3 sous-unités périphériquesPsaC,PsaDet PsaE

29. PsaE PsaC PsaD membrane Les 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE sont impliquées dans la liaison de la ferrédoxine

30. photosystème I cytochrome c6 (plastocyanine) glutamate synthase (GOGAT) ferrédoxine-thiorédoxine- réductase (FTR) nitrite réductase sulfite réductase 6 e- 2 e- ferrédoxine-NADP+- réductase (FNR) 2 e- 2 e- hydrogénase

31. Ferrédoxine-NADP+-oxydoréductase (FNR)

32. Nitrite réductase

33. Modèle d’une hydrogénase d’algue verte

34. flavine adénine 2 Fd- + FAD + H+ 2 Fd + FADH- FADH- + NADP+ FAD + NADPH Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase (FNR) FAD (flavine adénine dinucléotide) 2 Fd- + NADP+ + H+ 2 Fd + NADPH Serre et al. (1996) J. Mol. Biol. 263, 20

35. FNR (ferrédoxine-NADP+-réductase) NiR (nitrite réductase) 600 nm 580 nm - FNR/NiR : PSI seul - : PSI + Fd - : PSI + Fd + FNR/NiR + + +

36. [FNR] Conditions de pseudo-1er ordre : [FNRtotale] >> [PSI]  [Fdred] et[FNRox]  [FNRtotale] [Fdtotale] >> [PSI]  [FNRsq] et [Fdox]  [Fdtotale] kred = k1 [FNRtotale] kox = k-1 [Fdtotale] koff PSI.Fdred PSI + Fdred k1 Fdred + FNRox Fdox + FNRsq k-1 Réduction à 1 électron de la FNR (sans NADP+) Observation de la FNR seule à 630 nm

37. Cte d'équilibre rédox : Keq= k1/k-1= 2.7 E0(Fdox/Fdred) - E0(FNRox/FNRsq) = (RT/F)  ln(Keq) = 25 mV E0(Fdox/Fdred) = -412 mV  E0(FNRox/FNRsq) = -387 mV koff = 800 s-1 k1 = 4.1  108 M-1s-1 k-1 = 1.5  108 M-1s-1

38. FB FA k'on = 3.5  108 M-1s-1 Kd k'on = 160 s-1 k"off = 800 s-1 Kd = 0.45 µM = koff/kon PSI = photosystème I Fd = ferrédoxine PSI- = (FA,FB)- k'on< kon ou k"off > koff

39. ferrédoxine oxydée surface de Fd à l'interface avec les partenaires ferrédoxine réduite Morales et al. (1999) Biochemistry 38, 15764 Refined X-ray structures of the oxidized, at 1.3 Å, and reduced, at 1.17 Å, [2Fe-2S] ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena PCC7119 show redox-linked conformational changes Modèle proposé : après sa réduction, le changement conformationel de la ferrédoxine favorise sa dissociation du photosystème I: k"off > koff

40. pas de NADP+ [PSI] = 2.0 µM [Fd] = 4.0 µM [FNR] = 0.8 µM k2/k1 = 1  0.25 k2/k-2 20 E0(FNRox/FNRsq) (-387 mV) <E0(FNRsq/FNRred) ( -335 mV)

41. 2 Fdox 2 Fdred étape 7 : transfert d’hydrure : FADH- + NADP+ FAD + NADPH

42. Nitrite réductase Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054

43. NO2- NH4+ 90° Nitrite réductase agrégat 4Fe-4S hème e- protéine 6 Fd- + NO2- + 8 H+ 6 Fd + NH4+ + 2 H2O

44. ferrédoxine agrégat 4Fe-4S hème nitrite réductase Nitrite réductase 6 Fd- + NO2- + 8 H+ 6 Fd + NH4+ + 2 H2O ferrédoxine [2Fe-2S] : Em = -410 mV agrégat [4Fe-4S] : Em = -370 mV sirohème : Em = -290 mV Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054

45. Cycle catalytique de la nitrite réductase Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 510

46. CF: piston; C, F: seringues; M: mélangeur; OC: cellule optique; I0: lumière incidente I: lumière transmise Mélange rapide (stopped-flow) de 75 µM nitrite réductase et 25 mM NaNO2 cinétique à 563 nm : k = 0.45 s-1 Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 10765

47. [Fd-] = 3 µM Réoxydation de Fd- nitrite réductase (NiR) [NaNO2] = 1.5 mM réoxydation de Fd- par NiR (catalyse) réoxydation de Fd- par O2 [PSI] = 3 µM [Fd] = 6 µM Vitesse initiale : 160 Fd réoxydées par NiR et par s La fixation de NO2- sur la NiR oxydée est beaucoup trop lente par rapport à cette vitesse. Cc: cette réaction n'a pas lieu au cours de la catalyse. Différentes possibilités : - NO2- se fixe beaucoup plus rapidement sur une forme réduite de NiR - NO2- se fixe lors d'un échange avec la sortie du produit NH4+, ...

48. 2 Fd- + 2 H+ 2 Fd + H+ + H- H+ + H- H2 Modèle d’une hydrogénase à fer d’algue verte 2 Fd- + 2 H+ H2 D’après la structure de l’hydrogénase à fer de Clostridium pasteurianum. Peters et al. (1998) Science 282, 1853

49. Hydrogénase à fer centre di-fer centre fer-soufre Cluster H cystéine pontante H2 H+ H- CO CN centre di-fer

50. photosystème I - + La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite [PSI] = 2 µM 540 nm