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基因组 DNA 的杂交专题之二

基因组 DNA 的杂交专题之二. 基因组 DNA 的酶切. Southern 杂交. DNA 分子杂交，双链 DNA 分子的变性并和带有互补序 列的同源单链间的配对过程. 重组体筛选 基因筛选 DNA 同源性检测 基因定位 物理图谱. 用途. Southern 流程示意. 基因组 DNA. 限制性酶切. DNA 限制片段. 琼脂糖凝胶电泳. 盖子 两 层长滤纸 三 层湿滤纸 凝胶 n + 尼龙膜 三 层湿滤纸 十 层干滤纸 10cm 吸水纸. 转 膜. 转移缓冲液. 与标记探针杂交. 检测.

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基因组 DNA 的杂交专题之二

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Presentation Transcript

  1. 基因组DNA的杂交专题之二 基因组DNA的酶切

  2. Southern 杂交 DNA分子杂交，双链DNA分子的变性并和带有互补序 列的同源单链间的配对过程 重组体筛选 基因筛选 DNA同源性检测 基因定位 物理图谱 用途

  3. Southern流程示意 基因组DNA 限制性酶切 DNA限制片段 琼脂糖凝胶电泳 盖子 两层长滤纸 三层湿滤纸 凝胶 n+ 尼龙膜 三层湿滤纸 十层干滤纸 10cm吸水纸 转 膜 转移缓冲液 与标记探针杂交 检测

  4. 基因组DNA的酶切 • 在灭菌的1.5mL管中，按下表准备酶切反应体系 • 37℃保温至少3小时 • 加入1／10体积的3mol/L NaAc pH5.2和2倍体积的无水乙醇 • 室温沉淀20分钟 • 12，000r/min 离心10分钟，弃上清。 • 室温干燥 • 加入10uL TE溶解

  5. 一、核酸探针的标记 • 1、非放射性标记 • 生物素（bio-11-dUTP或bio-7-dUTP）（哺乳动物中普遍存在，背景高） • 地高辛（DIG，洋地黄类植物专一合成的复合物，DIG-11dUTP) • 荧光素（用的不普遍） • 随机寡核苷酸引物法、PCR、切口平移、末端转移等酶学方法都可标记探针 • 2、放射性标记----同位素标记

  6. 二、核酸探针的检测 杂交后非放射性标记探针的检测 酶联单抗或多抗—比色、产荧光、化学发光 • 比色：碱性磷酸酶 • 荧光检测：碱性磷酸酶 • 化学发光： 辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶

  7. DIG－dUTP

  8. BCIP 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐 AP BCI Ab1 还原 氧化 DIG 浓紫色沉淀（二甲臢） 浓紫色沉淀 （二溴二氯靛蓝） 连接臂 探针 NBT（氮蓝四唑） 轻洗 靶序列 比 色 法

  9. HNPP 2-羟-3-奈酸-2’-苯基胺磷酸 HNP(荧光沉淀） 可用290nm紫外激发 AP AP Ab1 DIG 连接臂 探针 荧 光 法 靶序列

  10. 三、实验操作

  11. 0.7%琼脂糖凝胶25mL(1×TAE),含1uL GoldViewTM • 加样 DNA标准 8uL 含AKP质粒1uL 酶切产物 ＋ 1uL 10×loading buffer 基因组DNA 4.5uL ＋ 0.5uL 10×loading buffer • 电泳： 恒压80V电泳 • 当溴酚蓝染料移出凝胶前沿10min后，停止电泳 • 凝胶成像仪观察和记录电泳结果 1、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳

  12. （注： 操作要戴上一次性手套） 2、Southern转膜 预先裁剪： 尼龙膜一张（比凝胶大一毫米） 滤纸六张（膜一样大小） 滤纸二张（与膜同宽，长20cm） 纸巾一叠（共10cm厚)，大小均一纸巾与胶大小相同 滤纸十张，与胶同样大小

  13. （注： 操作要戴上一次性手套） 2、Southern转膜 切掉无样品的凝胶区域，并剪掉一角以标记点样顺序，然后转至玻璃平皿中  在室温下将凝胶浸泡在变性溶液中15分钟，并轻轻摇动  更换变性液继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻摇动 尼龙膜相应剪掉一个角，六张与膜一样大小的滤纸， 先用重蒸水浸湿  再放入变性液中浸泡约30min

  14. 在玻璃板上先放上约10cm高的纸巾上，并在其上放上10层同样大小的干滤纸在玻璃板上先放上约10cm高的纸巾上，并在其上放上10层同样大小的干滤纸 将夹心饼结构放到其上 在其上放两层浸湿转移缓冲液的滤纸（滤纸的两端浸入转移缓冲液中）  盖上盖子，让凝胶上的DNA下行转移16小时或过夜  将尼龙膜与凝胶剥离，将膜浸在中和缓冲液中，室温15分钟，并轻轻摇动  更换中和缓冲液继续室温浸泡15分钟，并轻轻摇动 制作夹心饼式的结构（由下至上):三张潮湿的滤纸\膜\凝胶\三张潮湿的滤纸（胶与膜的切角对齐,千万不要有气泡）

  15. （注： 操作要戴上一次性手套） 3、Southern杂交 预杂交： 将膜放入杂交管中，加入预杂交液，在65℃杂交炉中预杂交过夜 （4℃保存一周） 杂交：将含膜的杂交管从4℃转入杂交炉中，待杂交液变清后取出，打开盖子，将预杂交液倒出  小心取出膜，转入装有5ml杂交液（含有探针的新鲜预杂交液）的袋子中，尽量将袋中的空气全部挤出  热封机封口，轻轻挤压袋子以检查密封的强度是否完整 将袋子放在62℃恒温水浴中杂交16小时或过夜 方向，标记 探针变性：100℃加热5min迅速放入冰水浴中冷确

  16. 重要  洗膜：一洗：2×SSC ＋ 0.1%SDS 15min×2，室温慢摇  二洗：1×SSC ＋ 0.1%SDS 15min×2，室温慢摇  三洗：0.5×SSC ＋ 0.1%SDS 20min×2，65-68℃慢摇  四洗：0.1×SSC， 15min，室温慢摇

  17. 4、Southern检测 将膜放入洗涤液中，在15－25℃振摇5min  将膜放入封闭液中，保温40min  将膜放入抗体溶液(用封闭液1：5000稀释DIG－Ab－AP)中，保温30min  用洗涤液洗涤膜两次，每次20min  将膜放入检测缓冲液中，平衡2－5min  将膜放入2mL新鲜准备的有色底物溶液(2mL检测缓冲液 ＋ 40uL NBT/BCIP)中，避光使可见的有色斑点产生（千万不能摇动）  待颜色达到所需的程度时，用无菌水或TE浸泡5min即可终止反应

  18. 试剂配制与灭菌

  19. 1. 20×SSC 400mL/班 3mol/L NaCl 0.3mol/L 柠檬酸钠 用2mol/L HCl调pH7.0 2. 变性溶液（碱性转移缓冲液） 400mL/组 0.4mol/L NaOH 2mol/L NaCl 3.中和缓冲液 100mL/组 0.5mol/L Tris-HCl pH7.2 1mol/L NaCl 4.马来酸缓冲液 1000 mL/班 0.1mol/L马来酸－NaOH pH7.5（20℃） 0.1mol/L NaCl 5. 洗涤液 1000 mL/班 马来酸缓冲液 ＋ 0.3％（V/V） Tween20 6. 检测缓冲液 500 mL/班 0.1mol/L Tris-HCl pH9.5（20℃） 0.1mol/L NaCl

  20. 灭菌： 1. 20×SSC 2.马来酸缓冲液 3. 洗涤液 4. 检测缓冲液 5. 蒸馏水300mL/组 清点与洗涤器皿：试剂瓶，枪头盒等等

  21. 分子克隆与表达实验报告

  22. 目的基因的扩增————PCR扩增 空载体获得——————质粒DNA提取 表达载体制备—————DNA重组 重组子筛选——————转化克隆株 蓝白筛选鉴定 重组基因原核表达———转化表达株IPTG诱导表达 目的蛋白活性检测———AKP酶活测定 电泳 Western Blot

  23. 只要坚持，总会有一盏为你而亮的灯！

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