Introduction

1. Introduction Pr Eric Chabriere

2. Nous sommes à l’ère post génomique Une macromolécule c’est: Une séquence, une structure (dynamique), une (des) fonction(s) beaucoup de séquences, peu de fonction

3. La connaissance de la structure 3D est révolutionnaire pour l’étude du vivant C’est souvent une interprétation directe • La structure: • -Informations précise sur le repliement • -détermination des interactions • protéine-protéine, protéines-substrat, protéines-cofacteur,… • -Mécanisme catalytique, reconnaissance moléculaire • Révèle les liens fonctionnels et évolutifs • Base pour les biotechnologies • Inhibiteurs, médicaments, mutants • Il faut intégrer les informations structurale avec les informations de génétiques, biochimie, biologie cellulaire, biologie moléculaire, bioinformatique… La biologie structurale : le microscope moderne

4. Les échantillons biologiques sont de taille variée

5. L'infiniment petit 1 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 molécule protéine atome fourmi homme noyau de l'atome cellule Les outils d'observation collisionneur de particules CERN rayonnement synchrotron rayons X L'œil microscope Pus on veut voir petit, plus l'instrument est grand

6. Principe : Soumettre le système à une excitation et étudier ses réactions Système à étudier e.g. solution aqueuse, cristal Signaux ‘émis’ par le système sous l’effet de la ‘sonde’ e.g. Transmission Diffusion à ‘grands’ angles ‘Sonde’ e.g. faisceau de lumière Rayons IR : Spectro Infra rouge Champ radiofréquence + champ magnétique : RMN Ionisation + champs E et B : spectro de masse Rayons X : diffraction X Neutrons, électrons Contiennent de l’information sur les caractéristiques du système

7. La biologie structurale est un processus complexe et interdisciplinaire

8. Les différentes techniques Radiocristallographie principe: interaction RX matière Avantages: positions précises des atomes, pas de limite de taille (ex ribosome). Inconvénients: cristal, problème de la phase, atomes d’hydrogène difficiles à voir RMN principe: Interaction des spins des noyaux dans un champs magnétique. Information sur l’environnement de chaque noyau. Avantages: En solution, Information sur la dynamique de la macromolécule. Inconvénients: Limitation de taille (30kDa avec marquage), moins précis que la cristallographie, solution concentrée Microscopie électronique principe: interaction électron matière Avantages: Pas de problème de phases (lentille) pas de limite de taille (ex virus). structure globale Inconvénients: basse résolution, dommage sur l’échantillon PFOR (2PDA) Prion humain (1HJN) Virus coxsachie Cav21

9. Diffusion des rayon X : Small Angle X-ray Scattering (SAXS) principe: interaction RX matière Avantages: échantillon en solution, pas de cristal Inconvénients: basse résolution Neutrons (complément à la radiocristallographie) principe: interaction neutrons matière Avantages: les atomes d’hydrogène sont visibles Inconvénients: Gros cristaux Bioinformatique (en très fort progrès) Principe: modélisation in silico, Avantages: peu cher, rapide inconvénients: précision, qualité des résultats Chimie-physique principe: marquage, spectroscopie, biochimie, … Avantage: Informations Inconvénients: Mesure indirect, interprétation the modular cellulase Cel48F from Clostridium cellulolyticum Dichroïsme circulaire Aucune technique n’est complète tout est bon à prendre

10. Ere de la génomique structurale

11. Comparaison des structures déposées (PDB) avec les différentes techniques La cristallographie est le méthode la plus utilisée

12. La lumière: une dualité. La lumière est une particule. Les "grains de lumière" s'appellent les photons La lumière est une onde. De lumière + de la lumière peut créer de l'obscurité. (interférences destructrices) 2 réalités à priori contradictoires peuvent coexister. Ce n'est pas parce qu'on a raison, qu'un avis contraire est forcement faux.

13. Transformé de Fourrier On éclaire un objet avec une onde (lumière, RX, neutrons, électrons,..) l'objet diffuse. image objet T.F-1 T.F Diifusion =transformé de fourier Une lentille permet de refaire uen transforme de Fourier inverse Tous les rayons issus d’un point objet convergent sur un unique point image. Uniquement des lentilles pour les électrons On perd les phases dans les autres techniques

14. TF Plus l'objet est petit plus il diffuse. A partir de la diffusion on peut obtenir des information de taille et de forme

15. TF TF La reptition d'un motif amplifie le signal dans certaine direction. C'est la diffraction. Diffraction est une diffusion particuliere

16. Etapes en biocristallographie Gène d’intérêt Expression purification cristallisation diffraction Echantillon biologique Structure de complexes phasage Interprétation biologique Biologie moléculaire modélisation Bioinformatique Autres informations Biotechnologies 2 étapes limitantes: cristallisation et phasage

17. Cout d’une structure

18. La purification. Pour cristalliser, l’échantillon doit être le plus pur possible (>98%). Il en faut une quantité importante de protéine 5-10mg (concentration 5-20mg) Vérifier systématiquement la qualité du lot: Gel SDS, coloration argentique activité

19. La cristallisation Obtenir un maximum d’information sur la stabilité de l’échantillons. Connaître les conditions de cristallisations de protéine voisine Plusieurs techniques. -Goutte suspendue -Goutte assise -batch Il existe des robots de cristallisation Génomique structurale

20. Pour amplifier la lumière, on a besoin de cristalliser l'objet étudié Un cristal, est la répétition régulière d’un motif dans l’espace Attention, le cristal de Baccarat et Daum ne sont pas cristallin au sens chimique (objet amorphe, sans organisation régulière)

21. Le cristal: pureté et lumière. La pureté: Dans le cristal on a un seul motif La lumière: Lorsqu’on éclaire un cristal avec les rayons X, on a un réseaux de taches très lumineuses On a aussi un réseau de tâches sombres. La lumière + la lumière peut créer l'obscurité (interférences destructrices). RX

22. La diffraction permet de voir les atomes d = 1 Å RX A partir de ces données (interférences), on peut revenir à la densité électronique. C'est un microscope à l'échelle atomique

23. La diffraction Rayons X Neutrons Transformée de Fourrier Il faut que les cristal diffracte bien (résolution + monocristal)

24. A Grenoble Anode tournante (laboratoire) Synchrotron ESRF Réacteur à neutrons ILL Les synchrotrons dans le monde

25. Le phasage Pas de lentille de qualité pour les rayons X. Plusieurs techniques remplacement moléculaire on utilise les phase du modèle d’une protéine similaire (id seq >30%) dérivé d’atome lourds (MIR) On fixe des atome lourds sur la protéine (Hg, U, Tb, …) diffusion anomale (synchrotron) on utilise le propriété de diffusion anomale des atomes lourds (>Fe) Soit naturelle (ex agrégats 4Fe-4S) Soit fixé (Mir) Soit acide aminé modifié (ex Selenomethionine). (expression) Méthodes Directes Si reolution atomique (< 1,2Å)et petite protéine (<10Kda)

26. Modélisation Rayons X Neutrons Transformée de Fourrier En calculant la transformée de Fourier inverse on obtient la densité électronique de la molécule On place les atomes dans la densité électronique Il faut connaître la séquence

27. d = 4 Å Notion de résolution Plus la résolution est faible plus on pourra voir des détails fin Difficile de construire le modèle

28. d = 3 Å On commence a reconnaitre les acides aminé

29. d = 2 Å A cette résolution on peut voire les molécule d’eau

30. d = 1 Å Résolution atomique On voit chaque atome séparément

31. La structure

32. Le fichier PDB: les coordonnées de chaque atomes N° atome -- type d'atome– résidu–chaine--N° séquence—X- Y- Z—occupation—Facteur B Facteur d’agitation thermique (facteur B) Entre 2 et 60 Å2 Plus il est élevé, plus l’atome est agitée

33. Coloration en fonction du facteur B On voit les zones agité (attention petite vibration)

34. Interprétation Biologique Structure + complexe Mécanisme catalytique

35. Applications : Empoisonnement par le mercure Le mercure se fixe sur les protéines (atomes de souffres) Le mercure bloque le canal

36. De nouveaux médicaments Hémagglutinine Acide sialique neuraminidase Virus influenza La neuraminidase se situe à la surface du virus influenza (Grippe). La neuraminidase coupe les acide sialiques (sucres) et favorise la traversé de la membrane.

37. Inhibition de la neuraminidase (Tamiflu) La compréhension de la fixation du médicament au niveau moléculaire permet de développer de nouveaux médicaments plus efficaces

38. Evolution Les séquences des gènes (génomique) ne nous renseignent pas toujours sur la fonction de la protéine codée. Des séquences très différentes peuvent avoir des repliements très similaires HPBP (humaine) E. Coli (bactèrie) M. Tuberculosis (bactèrie) Malgré une grande différence macroscopique, on peut trouver une très grande similarité au niveau microscopique

39. RMN: résonance magnétique nucleaire. Le noyau de certains atomes possède un spin. 1H, 13C, 15N, 31P. B Le spin (aimant s'oriente dans un champs magnétique) Si on applique la bonne fréquence électromagnétique radiofréquence aux spin alignés (adapté en fonction du champs magnétique et de la nature de l'atome). Il y a résonance: les spins basculent. Il sont dans un état excité B Pour revenir à l'état stable, le spin va précesser (ex toupie) La vitesse de précession est dépendante de l'environnent chimique Cette vitesse de précession nous renseigne. Sur les liaisons, la proximité spatiale, la géométrie … Sur la structure

40. Appareille de RMN. Doit générer un champs magnétique très intense (10-15 T) Champs magnétique terrestre (47mT) L'échantillon doit être pur, concentré, soluble, stable (collecte plusieurs jours). La macromolécule ne peut être trop grosse (max 30Kda, avec marquage isotopique)

41. Spectre 1D. A chaque pic correspond un proton Spectre 2D. Couplage scalaire, dipolaire. Attribution + géométrie. Plusieurs spectres sont nécessaires

42. En RMN, on obtient une série de modèles

43. RMN. Protons (ou N15). petit échantillon 10-20 kDa petits oligonucléotides mesure des complexes. Dynamique des protéines

44. Microscopie électronique:

45. Les électrons sont des ondes (dualité onde particule) h constante de Planck : 6.626 10-34 Js l= h/mv Les lentilles sont des bobines magnétiques Les électrons interagissent avec le potentiel électrostatique Pb: contraste peu important, le flux d'électron détruit l'échantillon. On voit la projection du potentiel électrostatique

46. Coloration négative Sur une coupe mince de l'échantillon (dizaine nm), on rajoute un solution contenant des atomes lourds (tetraoxyde d'osmium ou de l'acétate d'uranyl). Ces atomes qui absorbent beaucoup les électrons vont se déposé en dehors de la macromolecules. Aini, la macromolécule apparaitra plus clair que ce qui l'entoure. (contraste négatif)

47. Cryo EM. L'échantillon est rapidement congelé dans la glace vitreuse Faible contraste L'échantillon est aléatoirement orienté Reconstruction 3D Resolution environ 10A

48. On place les modèles X-ray et RMN dans l'enveloppe obtenue par microscopie électronique

49. RX. On voit les électrons. Structure précise Il faut des cristaux RMN On voit les spins. Inadaptée au grosse macromolécule Microscopie électronique Projection du potentiel électrique Faible résolution (10Å) Reconstruction 3D, fastidieuse. Adapté à à les résolution de très gros complexe Combinaison avec structure RX et RMN