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I. Support et organisation de l'IG II. Méca. de conservation de l'IG III. Mécanismes moléculaires de l'expression de PowerPoint Presentation
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I. Support et organisation de l'IG II. Méca. de conservation de l'IG III. Mécanismes moléculaires de l'expression de

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  1. A. Transcription de l'ADN en ARN B. Traduction de l'ARN en protéines C. Particularités d'expression des virus I.Support et organisation de l'IGII. Méca. de conservation de l'IGIII. Mécanismes moléculaires de l'expression de l'Information génétique

  2. A. Transcription de l'ADN en ARN  flux d'information orienté noyau  cytoplasme - Localisation synthèse protéique ds cytoplasme : Exp. Pallade 1950 Nécessité et identification d'un intermédiaire entre ADN et protéines : l'ARNm - Pb : intermédiaire = vecteur + message - Rappels : tous les ARN à la fois dans noyau et cytoplasme ARN r (80%, à 23, 16 et 5S chez Procaryotes 28, 18, 5.8 et 5 S chez Eucaryotes) ARN t (15%, environ 60 différents) Mais : - Trop peu diversifiés / protéines - Trop stables . - Test de Monod et Jacob (1960) sur système inductible  apparition d'un ARN instable en partie complémentaire de ADN

  3. A. Transcription de l'ADN en ARN 1- Modalités de la transcription chez les procaryotes a) Des ribosomes associés précocement aux ARNm

  4. b) Influence des propriétés de l'ARN pol sur l'initiation de la transcription Rôle des sous-unités : - a2 : permet association à b/b' - b : liaison à l'ARN; catalyse initiation (rifampycine) + élongation (streptolydine); reconnaissance des terminateurs - b' : liaison à l'ADN (70%) et au facteur s - s : reconnaissance promoteurs  précision de l'initiation - structure quaternaire : a2, b, b', s - 480 kDa; - se fixent sur 5 tours d'hélice (15 nm) - Demi-vie = 60 min.

  5. Rôle du facteur s : - Variabilité : - s43 pour phase végétative - devient s37 qui permet de - coder pour s29 qui code un nouveau jeu de gènes pour la phase de sporulation - Reconnaissance de séquences promotrices (1 sec.) - Ouverture du Complexe d'initiation : rupture liaisons H sur 10 à 14 nt - Incorporation des 6 à 9 premiers ribonucléotides Ensuite  transcription par ARNpol sans facteur s.

  6. c) Influence des séquences promotrices sur l'initiation de la transcription - Cas de l'opéron lactose : mise en évidence de l'interaction ADN / protéines ARN pol de -60 à +20 Interaction forte de -20 à + 20 - Boites ubiquites sur promoteur proximal : TATAAAA en -10  zone d'ouverture TTGACA en -35  reconnaissance par ARN pol

  7.  Eléments inductibles sur certains promoteurs : HSE (Heat Shock element) 14 nt Active gènes codant pour des protéines qui protègent la cellule contre les réactions dues à la chaleur (Ex . protéines chaperonnes, protéines de l'immunité lors de fièvre...) - Position variable par rapport à TATA - Suffisants pour conférer à n'importe quel promoteur le caratère de choc thermique IRE (Interferon regulatory element) GRE (glucocorticoïdes ) MRE (sensible à la présence de [métaux] trace)

  8. d) Modalités de l'élongation lors de la transcription - Nécessité d'un brin matrice - Pas de nécessité d'amorce - substrats : dnTP - Taux d'erreur : 10-4 à 10-5 très élevé car pas d'activité exonucléasique. (idem virus à ARN comme SIDA très changeant) - Vitesse : 40 nt/s chez E.Coli; 200 nt/s Phage d'E.Coli - Importance de la topologie de l'ADN : - in-vitro : l'ADN super enroulé est transcrit plus vite que ADN déroulé - in-vivo : mutants de topoisomérase II (gyrase : provoque les super enroulements )  transcription diminuée mutants de topoisomérase I (catalyse la relaxation des supertours)  transcription augmentée.

  9. e) Terminaison de la transcription - Séquence de détachement de l'ARNpol : palindrome G/C + séquence riche en A/T - Palindrome permet la réalisation d'une épingle à cheveux (tige/boucle) qui détache l'enzyme - Terminateurs dépendants d'un facteur protéique r : interagit avec ARN pol lors d'une pause au niveau du terminateur -  antiterminateurs dans boîtes NUT (20 nt) en amont de terminateur : fixent prot NUS A et N modifie l'ARNpol  ne reconnaîtra plus le terminateur quand elle passera dessus.

  10. f) Contrôle de la transcription : cas des opérons

  11. ARN pol Represseur Inducteur

  12. 2- Modalités de la transcription chez les eucaryotes Rappel : Découplage transcription / traduction dû à l'enveloppe nucléaire a) Diversité des ARN pol eucaryotes ARNpol I - transcripition des gènes codant pour ARNr45S dans le nucléole (où aura également lieu la maturation des ARNr et l'association avec sous-unités ribosomiales) ARNpol II - transcription des gènes de structure + gènes ARNhn des RNP ARNpol III - transcription des gènes ARNt et ARNr5S et autres petitsARN

  13. b) Diversité des séquences promotrices participant à l'initiation de la transcription Boites ubiquites sur promoteur proximal : TATA  précise l'initiation au nt n°1 site START et fixe prot TBP (sous unité de TFIID) GC (CCGCCC)  cas des gènes "de ménage" (cas des gène sans boite GC : impliqués dans contrôle du développement embryonnaire) CAAT fixe CTF Octamère (ATTTGCAT) : fixe OTF

  14. Cas des gènes à plusieurs promoteurs : ex. gène de l'amylase : 2 Promoteurs P1 et P2 différents (tissu spécificité; boite TATA). P1 utilisé dans les glandes salivaires et P2 dans le foie. Les 2 promoteurs peuvent ici fonctionner en même temps dans une même cellule

  15. c) Modalités de l'élongation et de la terminaison de la transcription - Elongation : idem Procaryotes - Terminaison : mal contrôlée (peu de conséquences)

  16. d) Contrôle de l'initiation de la transcription Beaucoup plus fine que chez les Procaryotes  Contrôle par état de la chromatine Mee de Gurdon par transfert de noyau de jeunes embryons de xénope :  substance cytoplasmique régulée capable de rendre efficaces tous les gènes Dans cellules différenciées, une partie de l'info est non lue (mise sous silence, par méthylation notamment et reploiement de l'ADN en hélice Z par exemple) Mee du rôle rétro-inhibiteur des protéines histones dans la transcription : - En système acellulaire : plus il y a d'histones, moins la transcription se fait - in vivo : méthylations par H3 perturbent reconnaissance par ARN pol

  17.  Contrôle par séquences régulatrices en CIS Mee des URS (upstream regulatory sequences) : transfert de gène (vecteur viral non pathogène)

  18.  Contrôle par séquences régulatrices en CIS - Lieu de fixation de dimères protéiques (facteurs de transcription) - Interaction avec complexe de préinitiation - Régulation positive ou négative Cas des Enhancers et Silencers : - Séquences éloignées - Action par reploiement des l'ADN

  19.  Intervention des facteurs de transcription - Propriétés générales des TF : domaine de liaison à l'ADN homéodomaine, agrafe à leucine et doigt de Zn

  20.  Modélisation de l'initiation de la transcription

  21.  Modélisation de l'intervention des gènes de commande - 5% des gènes sont dits "de commande"  tissu-spécifiques - Séquence homéoboite 180 nt codant pour homéodomaine (60 aa)  aa 47, 50, 51 et 54 entrent dans grand sillon d'ADN - Séquence de l'ADN fixant ces aa très conservée GAAAGCCATTAGAG - Cas des gènes homéotiques : provoquent homéose (mais pas toujours homéoboite)

  22. Bonne corrélation spatiale chromosome / individu

  23. - Cas des gènes de développement : Ne provoquent pas d'homéose Possèdent homéoboite + "paired" + octapeptide Ex. gènes Pax

  24. Mécanisme d'action des gènes de développemnt Cas des gènes Pax : Pax-6 = gène "maître"  régule ensemble de gènes "secondaires" régulant expression d'autres gènes-cibles  cascade de 2000 à 3000 gènes mise en place d'une structure comme l'œil

  25. A. Transcription de l'ADN en ARN B. Traduction des ARNm en protéines C. Particularités d'expression des virus III. Méca. de l'expression de l'IG

  26. Observation des ribosomes sur ARNm - Expérience de Gros : marquage préalable des ribosomes 35S (+ [Mg2+] élevéeévite déstabilisation) + marquage court des ARNm au 14C ou U tritiée. - Chez Procaryotes : traduction immédiate, couplée à transcription dans le cytoplasme - Chez Eucaryotes : REG + poly(ribo)somes cytoplasmiques (un ribosome tous les 80 nt soit 10 à 20 ribosomes pour une protéine moyenne de 400 aa).

  27. 1- Modalités de la traduction chez les procaryotes Rappel : synthèse en batterie + ARN polycistronique = amplification du message a) Prise en charge des aa par les ARNt L'aminoacyl-ARNt-transférase (dimère ou tétramère) - spécifique d'un aa ( 20 aminoacyltransférase) -  ARNt isoaccepteur (flottement du code) - hydrolyse ATP en AMP intermédiaire acide aminé-adényl monophosphate + 2 Pi  liaison ester covalent en 3'OH de la queue ACC de l'ARNt + détachement de AMP

  28. b) Initiation de la traduction Les acteurs de l'initiation : - ARNm - ribosome - NformylméthionineARNt (ARNt initiateur) - facteurs d'initiation : IF3 (reconnaissance petite ss-u sur séquence Shine Dalgarno; inhibition par streptomycine), IF2 (fixation du 1er ARNt), IF1 (fixation de grande ss-u)

  29. Architecture des séquences de l'initiation : Rappel : pas de coiffe sur les ARNm des Procaryotes - 15 nt de long environ - complémentaire de séquence Shine Dalgarno (ARNr 16S de petite sous-unité 30S du ribosome) - riche en purine dont séquence conservée : AGGAGG - en amont (coté 5') du codon START (AUG)  assure positionnement précis à 1 nt près

  30. Fixation du 1er amino acyl ARNt sur petite sous-unité - Rappel : Nformyl méthionine ARNt - Fixation sur site P ("peptidyl") - Intervention de IF2 qui hydrolyse GTP Fixation à la grande sous-unité - Intervention de IF1 - Fixation du second aa-ARNt au site A - Site catalytique ribozyme de grande sous-unité forme lien peptidique (sans consommation d'énergie : utilise haut niveau énergétique des aminoacyls-ARNt) - Largage des IF consomme un GTP

  31. c) Elongation lors de la transcription - Sens 5'  3' de l'ARNm - Intervention de 2 sites distincts sur la grande sous-u ribosomiale - Site A (aminé) - Site P (peptide) - Site E (exit) très mal connu

  32. Polypeptide en cours de synthèse Sens de déplacement du ribosome

  33. peptidyl-ARNt ARNt sortant aa-ARNt hélice de l'ARN16S petite sous unité grande sous unité

  34. INITIATION ELONGATION Synthèse du lien peptidique + Trans-location Positionnement d'un nouvel aa-ARNt Charge de l'ARNt GTPGDP+Pi GTP GDP TERMINAISON Facteurs de terminaison + GTP GTPGDP GTPGDP Polypeptide+ARNt

  35. - Site A (aminé) : Arrivée de l'aminoacyl ARNt interagissant avec facteurs d'élongation + GTP pour l'appariement codon/anticocon - Site P (peptide) : synthèse de la liaison peptidique par action d'une petidyl transférase de la grosse sous-unité (inhibée par chloramphénicol) (sans consommation d'énergie) - Translocation : - Intervention d'un facteur translocase - consomme 1 GTP - Progression de 3 nt - Vitesse d'élongation : 20 aa/sec (pas très rapide mais plusieurs ribosomes en même temps)

  36. d) Terminaison de la traduction - Arrivée du codon STOP sur le site A - permet mise en place d'un facteur de dissociation qui permet l'hydrolyse de la liaison COOH- ARNt + 1 GTP - ce qui libère le polypeptide nouvellement synthétisé. - Coupure du Nformyl méthionine initial et séparation des 2 sous unités ribosomiales + 1 GTP

  37. BILAN : Coût de la polymérisation d'1 aa - 1 ATP pour activation de aa (rupture de 2 liaisons) - 1 GTP pour positionnement sur site A en présence de IF2 (plus 1 GTP pour premier positionnement de Nformyl méthionine ARNt sur site P) - 1 GTP pour Translocation - TOTAL : 4 liaisons Phosphoester pour une liaison peptidique + Initiation 1 GTP+ Terminaison 1 GTP

  38. 2- Différences de modalités de la traduction chez les eucaryotes a) Initiation - ARNt initiateur = Méthionine (et non Nformylmeth comme chez bactéries) - Methionine-ARNt chargée sur petite sous unité ribosomale avant fixation de l'ARNm +eIF2 - Autres facteurs d'initiation très nombreux et différents des procaryotes mais participent aux mêmes étapes. Contrôle précis du taux de synthèse en relation avec cycle cellulaire et nutriments disponibles dans le milieu ( Procaryotes) - Fixation de l'ARNm en 5' puis recherche ("en ligne") du premier codon start AUG (contrôlé par séquence Kozak) (GCC) A/G CC ATG G - libération des IF puis - fixation de grande sous unité

  39. b) Elongation - Elagage rapide de méthionine par amionopeptidase spécifique - Pas d'ARNm polycistroniques : premier codon AUG = START. les autres codons AUG ne peuvent plus servir - Deux destinées des Protéines : - cytosolique : par ribosomes libres - protéines intramembranaires ou excrétées : guidées dans REG par séquence signal 16 nt.

  40. 3- Contrôle de la traduction a) Contrôle par les ribosomes Contrôle de la population des ribosomes Ex chez E. coli : prot L35 et L20 (fixent ARN 23S) de grande sous unité ribosomiale codées sur un même opéron  grand ARN pré r possède longue séquence en 5' reployé en tiges/boucles mimant S3D de l'ARN23S  inhibition compétitive de L20 par son propre ARNm!