通心络对急性心肌梗死再灌注后 心肌无再流防治及其机制研究

1. 通心络对急性心肌梗死再灌注后心肌无再流防治及其机制研究通心络对急性心肌梗死再灌注后心肌无再流防治及其机制研究 中国医学科学院 阜外心血管病医院 杨跃进 尤士杰 赵京林 等 中国中西医结合大会， 天津，2009－9－5 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

2. 研究背景 • AMI • 冠脉急闭所致 • 首选冠脉再通治疗

3. AMI冠脉再通和心肌再灌注治疗 • AMI冠脉再通治疗：溶栓或冠脉介入（PCI） 开通闭塞血管 恢复冠脉供血 • 心肌再灌注：指恢复心肌组织供血 是治疗AMI的最终目标 冠脉再通 ≠ 心肌再灌注“无再流”导致心肌不能“有效再灌注”已经成为后再灌注治疗时代的主要障碍！ 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

4. 心肌组织无灌注(无再流)：影响AMI预后 溶栓治疗 冠脉再通 AMI PCI 37% 心肌组织无再流 严重心肌损害 充血性心力衰竭等 进行性的左室扩张 circulation,1999.100: 451-456 Am J C, 1998. 82: 932

5. 无再流现象（no-reflow phenomenon） • 冠脉已开通，无明显机械堵塞 • 在心肌水平无有效的再灌注 • 发生率可高达37-43% • 严重影响AMI患者的预后 Gersh BJ. Am Heart J. 1999; 138(2pt2): 188-202. Ito H, Maruyama A, Iwakura K, et al. Circulation. 1996; 93: 223-228. Ito H, Tomooka T, Sakai N, et al. Circulation. 1992; 85: 1699-1705. Abbo KM,Dooris M, Glaziar S. Am J Cardiol. 1995; 75: 778-82. Morshima J. Circulation. 1999; 100(Supple1): 451-456. 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

6. 微血管痉挛 微栓子栓塞 微血管结构完整性破坏 再灌注损伤 核心机制 Cardiomyocyte 心肌无再流 ？ Refflemann, Heart, 2002

7. 心肌无再流发生机制 • 微血管：痉挛 栓塞或血栓形成 结构完整性的破坏 • 缺血再灌注损伤 • 炎症和免疫反应 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

8. 无再流的核心机制假设？ • 微血管结构完整性：是AMI冠脉再通后心肌再灌注解剖学基础和前提 • 微血管结构和功能的完整性损伤或破坏：可能是无再流的核心机制 • 保护心肌微血管结构的完整性：可能是预防无再流、保证心肌再灌注的关键 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

9. 心肌无再流的核心机制假设依据 心肌微血管主要是由内皮细胞和基膜组成 电镜下，无再流区毛细血管内皮肿胀、突出 甚至脱落。 在Langendorff装置用生理盐水灌注的心脏也可出现无再流，说明血细胞不是无再流现象产生所必须。

10. 预防AMI无再流的主要措施 远端保护装置 血小板Ⅱa/Ⅲb受体拮抗剂 血管扩张剂

11. 远端保护装置---预防微血管栓塞 A, PercuSurge balloon occlusion device with aspiration catheter. B, Angioguard guide- wire filter device

12. 无再流的防治 • 远端保护装置、旋切和抽吸技术——EMERALD和PROMISE研究结果阴性 • 血管扩张剂，如钙拮抗剂、腺苷、KATP通道开放剂——作用机制尚不清楚，无大规模临床研究证据 • 血小板Ⅱa/Ⅲb受体拮抗剂——有改善心肌组织再灌注的疗效 增加患者出血的潜在风险 价格昂贵 以上措施虽显示出一定的疗效，但均未有突破性进展 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

13. 无再流时内皮功能受损 缺血时及再灌注后均存在内皮细胞功能受损 ---- 微血管对内皮依赖性舒张反应 我们的动物实验研究表明 ---- 再流区内皮功能 ---- 无再流区内皮功能 Ku DD. Science, 1982.218: 576-578. 杨跃进等. 中国新药与临床. 2005.6:151-156 赵京林等. 中国医学科学院学报. 2006.4:120-125

14. 无再流时－内皮结构完整性破坏

15. 益气通络，解痉止痛 补益心气，人参为君 臣 水蛭 佐 土元 臣 全蝎 佐 蝉蜕 蜈蚣 降脂抗凝 促进血流 活血通络 搜风入络 增加血供 解除痉挛 标本兼治 芳香通窍，降香、冰片为使 通心络的药理作用：保护血管内皮功能 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

16. 研究总设想（总假说，Hypothesis） 通心络 实验研究：6项 多中心临床研究：1项 重点：疗效 机制 保护内皮细胞和微血管 结构和功能 减轻心肌无再流 改善心肌灌注 保护心肌（直接和 间接）及其环境 改善心功能 和预后 中国医学科学院 中国协和医科大学心血管病研究所 阜外心血管病医院

17. 前期研究基础(急性心肌梗死前预给药3天) 通心络能有效保护微血管内皮细胞，防治再灌注后无再流 • 通心络显著降低血NO、ET-1和vWF水平，下调梗死区心肌NOS同功酶、ET-1、vWF及其mRNA的表达。 • 通心络能够提高梗死区心肌T-AOC、SOD、GSH水平，增强心肌抗氧化能力，有效抑制缺血再灌注所致的氧化损伤。 • 通心络可以抑制P-selectin、ICAM-1、VCAM-1等粘附分子表达，减轻炎症反应。 • 通心络可以抑制内皮细胞间连接蛋白VE-cadherin降解，保护内皮细胞结构完整。

18. 问题：(按临床要求，AMI再灌注前2－3小时给药)问题：(按临床要求，AMI再灌注前2－3小时给药) • 通心络（动物实验）急性期给药再灌注早期疗效如何？机制？ • 通心络（动物实验）急性期给药再灌注晚期疗效如何？机制？ • 临床疗效如何？

19. 急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 （一）通心络减少猪心肌梗死后无再流，呈剂量依赖性

20. 研究目标：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药研究目标：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 • 通心络对心肌无再流的防治疗效评价指标：MCE • 通心络对细胞黏附分子的抑制评价指标：P-selectin、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-10 • 通心络对微血管内皮细胞完整性的保护评价指标：VE-cadherin、MMP-9 • 通心络对心肌Neuregulin蛋白的影响评价指标：Neuregulin

21. PLACEBO ischemia reperfusion -180 0 90 270min 实验方法：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 SHAM TXL（大） ischemia reperfusion TXL（中） ischemia reperfusion ischemia reperfusion TXL（小） 270min 180 0 90

22. 实验结果：通心络对无再流的影响 *再灌注2小时，大剂量通心络组无再流区面积较对照组显著缩小（p<0.05）

23. 国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303 通心络对黏附分子水平的影响(剂量依赖)

24. 国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303 通心络对黏附分子水平的影响（剂量依赖）

25. 国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303 通心络对黏附分子水平的影响（剂量依赖）

26. 国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303国家重点研究发展计划973课题报告课题编号：2005CB523303 通心络对炎症因子水平的影响（剂量依赖）

27. 通心络对微血管内皮细胞完整性的保护 心肌组织VE Cadherin水平变化 心肌组织MMP-9水平变化 对照组 小剂量组 中剂量组 大剂量组 正常区 再灌注区 无再流区 正常区 再灌注区 无再流区

28. 通心络对心肌Neuregulin蛋白水平的影响 • Neuregulin是近年新发现的信号调控蛋白 • Neuregulin在心肌细胞发育、受损心肌修复中起到关键的信号调控功能 • 通心络对AMI后心肌Neuregulin水平的影响可能是其心脏保护作用的又一关键机制

29. 结 论 大剂量通心络在AMI再灌注前2－3小时给药 • 显著缩小心肌无再流面积 • 显著降低P-selectin、ICAM-1、VCAM-1等黏附因子水平；降低炎症因子IL-6水平，升高抗炎症因子IL-10水平，从而减轻微血管渗出，减轻梗死区心肌炎症浸润 • 显著提高VE-cadherin水平，降低MMP-9水平，保护微血管内皮细胞完整性 • 显著提高心肌Neuregulin蛋白水平，启动并调控受损心肌修复进程 对通心络在AMI缺血再灌注早期临床应用有积极参考意义…

30. 急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 （二）大剂量通心络减少猪心梗后无再流疗效不次于缺血预适应、他汀类药物，与保护内皮功能有关

31. 研究目标：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药研究目标：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 • 大剂量通心络对心肌无再流、坏死和凋亡的影响评价指标：病理染色和免疫组织化学 • 大剂量通心络与缺血预适应和他汀的疗效对比评价指标：病理染色和免疫组织化学 • 通心络疗效与NO的关系评价指标：VE-cadherin、病理染色和免疫组织化学

32. PLACEBO ischemia reperfusion -180 0 90 270min 研究目标（二）：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 SHAM L-NNA ischemia reperfusion TXL（大） ischemia reperfusion TXL+L-NNA ischemia reperfusion STATIN ischemia reperfusion ischemia reperfusion IP 270min 180 0 90

33. 通心络在I/R损伤中对NO生成的作用 apoptosis reduced coenzyme Ⅱ Ischemia/ Reperfusion injury TXL L-Arg+O2 NO （-） L-NNA eNOS + cofactors phosphorylation Protein content

34. 通心络增加冠状动脉前降支平均血流量 ※ ※ ※ ※ ※ ※

35. 通心络减少无再流和心肌坏死 # # # # # #

36. 通心络减少无再流和心肌坏死 缺血区 无再流区 坏死区

37. 通心络增加心肌组织eNOS活性 正常 再灌注 无再流

38. 通心络增加心肌组织VE-cadherin 含量（western blot） 联合 通心络 安慰剂

39. no reflow reflow normal Placebo TXL TXL+L-NNA 通心络增加心肌组织VE-cadherin含量（免疫荧光）

40. 通心络减少心肌组织中性粒细胞浸润（H-E染色中性粒细胞浸润评分）通心络减少心肌组织中性粒细胞浸润（H-E染色中性粒细胞浸润评分）

41. 通心络减少心肌组织中性粒细胞浸润（心肌MPO活性）通心络减少心肌组织中性粒细胞浸润（心肌MPO活性）

42. 通心络减少再流区心肌凋亡

43. TXL TXL+LNNA PLACEBO SHAM L-NNA 凋亡细胞染色

44. 结 论 • 通心络减小无再流和心肌死亡，疗效不次于缺血预适应和他汀药物治疗； • 保护血管内皮功能，介导NO生成是通心络产生保护作用的关键机制

45. 急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 （三）通心络对猪急性心肌梗死再灌注晚期微血管内皮功能、结构、凋亡和再生作用机制的研究

46. 研究目标：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药研究目标：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 • 通心络对微血管内皮保护作用评价指标：eNOS3、Ve-Cadherin • 通心络对微血管内皮及心肌凋亡的作用评价指标：Bax、Fas、Bcl-2 • 通心络对微血管再生的作用评价指标：FLK1和新生微血管密度

47. PLACEBO ischemia reperfusion -180 0 90 270min 实验方法：急性心肌梗死再灌注前2－3小时给药 SHAM TXL（小） ischemia reperfusion TXL（中） ischemia reperfusion TXL（大） ischemia reperfusion 180min 0 90min 7 days

48. AMI再灌注晚期通心络各组eNOS3蛋白表达量的比较AMI再灌注晚期通心络各组eNOS3蛋白表达量的比较 与假手术组比较, *P < 0.05 与对照组比较,+ P < 0.05 与小剂量通心络组比较, # P < 0.05 与中剂量通心络组比较, ΔP < 0.05 +# + *+ *+ * eNOS3与β-actin灰度比值 *+ * * 梗死区心肌 梗死边缘区心肌 正常区心肌

49. AMI再灌注晚期各组Ve-cadherin和vWF的比较 对照组梗死区 对照组梗死边缘区 对照组正常区 假手术组正常心肌 免疫荧光双染Ve-cadherin TRITC标记(红色)和VonWillebrand Factor FITC标记(绿色)

50. 通心络各组Ve-cadherin蛋白 表达 小剂量通心络组梗死区 小剂量通心络组梗死边缘区 小剂量通心络组正常区 中剂量通心络组梗死区 中剂量通心络组梗死边缘区 中剂量通心络组正常区 大剂量通心络组梗死区 大剂量通心络组梗死边缘区 大剂量通心络组正常区