Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
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Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs. Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette INSERM U366 - CEA Grenoble Sous la direction de Didier Job et Odile Valiron. Plan. Introduction : le cytosquelette microtubulaire. Objectifs.

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Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs

Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs

Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette

INSERM U366 - CEA Grenoble

Sous la direction de

Didier Job et Odile Valiron


Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
Plan étude et recherche d’effecteurs

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
Plan étude et recherche d’effecteurs

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Le cytosquelette microtubulaire
Le cytosquelette microtubulaire étude et recherche d’effecteurs

Mitose

Interphase


Structure des microtubules
Structure des microtubules étude et recherche d’effecteurs


Assemblage des microtubules
Assemblage des microtubules étude et recherche d’effecteurs

  • Eléments requis :

    • Concentration critique, température minimale

    • Source d’énergie: GTP

    • Solution adéquate (tampon, magnésium)

L’assemblage est réversible, nécessite de l’énergie, atteint un état stationnaire hors d’équilibre


Nucl ation des microtubules

Oligomères étude et recherche d’effecteurs

Feuillets

Nucléation des microtubules

DIMERES

MICROTUBULES


Elongation des microtubules

Elongation de feuillets étude et recherche d’effecteurs

Elongation des microtubules

Addition de dimères


Etat stationnaire

- étude et recherche d’effecteurs

+

Instabilité dynamique

Treadmilling

50

Longueur (µm)

30

10

0

2000

4000

Temps (s)

Etat stationnaire

  • Consommation d’énergie à l’état stationnaire

Flux de sous-unités


Dynamique des microtubules in vivo

Mitose étude et recherche d’effecteurs

Interphase

Dynamique des microtubulesin vivo

  • Une architecture dynamique

  • Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire

  • Renouvellement permanent des microtubules

  • Instabilité dynamique « tempérée »

  • Treadmilling


Contr le de la stabilit des microtubules
Contrôle de la stabilité des microtubules étude et recherche d’effecteurs

  • Protéines stabilisant les microtubules

    • MAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4

    • Lis1, Doublecortine

    • XMAP230, XMAP215, TOGp

    • STOP

  • Intégrateurs du cytosquelette

    • Plakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments)

    • MACF (microtubules, actine)

  • Protéines déstabilisantes

    • Stathmine, SCG10

    • XKCM1, Kar3p

    • Rev


Modulation du turnover des microtubules
Modulation du étude et recherche d’effecteursturnover des microtubules

  • Protéines liant l’extrémité plus des microtubules

    • Bim1, EB1, EB2

    • Tip1p


Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
Plan étude et recherche d’effecteurs

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Objectifs
Objectifs étude et recherche d’effecteurs

  • Réévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubules

  • Obtention et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubules


Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
Plan étude et recherche d’effecteurs

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Facteurs contr lant la dynamique des microtubules
Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules étude et recherche d’effecteurs

Mise au point de dosages

 Mesure simultanée de

- concentration en tubuline-GTP

- « masse » de tubuline assemblée

- distribution de longueurs des microtubules et longueur moyenne

 [Tubuline-GTP](t)

 m(t)

 l(t)

 [MT](t)

Tubuline complexée au GTP sans excès de GTP

Pas de système régénérateur du GTP

 la tubuline n’assemble qu’une seule fois


R actions d assemblages

Réactions d’assemblages

  • Désassemblage en dessous de la concentration critique


Nucl ation des microtubules1
Nucléation des microtubules étude et recherche d’effecteurs

  • Vitesse de formation de nouveaux microtubules :

  • Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP

  • Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP

  • Exposant de nucléation : environ 6,2


Elongation des microtubules1
Elongation des microtubules étude et recherche d’effecteurs

Vitesse d’élongation indépendante de :

- concentration instantanée de tubuline-GTP

- concentration initiale en tubuline-GTP

 Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?


D sassemblage des microtubules
Désassemblage des microtubules étude et recherche d’effecteurs

Des facteurs de catastrophes

 des oligomères ?

Désassemblage par catastrophes

Indépendant de la longueur


Facteurs contr lant la dynamique des microtubules1
Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules étude et recherche d’effecteurs

  • Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubules

  •  Des oligomères de tubuline ?

  • Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules

  •  Fermeture de feuillets

  • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophe

  •  Des oligomères facteurs de catastrophes ?


Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
Plan étude et recherche d’effecteurs

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Recherche d oligom res de tubuline contr lant la nucl ation des microtubules
Recherche d’oligomères de tubuline contrôlant la nucléation des microtubules

  • Production d’assemblages de tubuline stabilisés par pontage covalent

    • Protocole dérivé de méthodes de production « d’amorces » de microtubules : pontage modéré

  • Assemblage de microtubules puis traitement modéré à l ’EGS

  • Collecte des fragments de microtubules stabilisés

  • Filtration éliminant les particules de plus de 100 nm


Caract risation des solutions d oligom res de tubuline
Caractérisation des solutions d’oligomères de tubuline nucléation des microtubules

  • Les solutions d’oligomères stimulent l’assemblage des microtubules sous la concentration critique

  • Absence de fragments de microtubules dans les solutions

  • - filtration 100 nm

  • - observation en immunofluorescence


Caract risation des solutions d oligom res

Diffusion de lumière nucléation des microtubules

Microscopie électronique

Caractérisation des solutions d’oligomères

  • Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm)

  • Des oligomères linéaires


Structure des oligom res

Association latérale nucléation des microtubules

Association longitudinale

Feuillet

Structure des oligomères

  • Liaison de GTP par le dimère de tubuline

  •  échangeable sur la sous-unité b

  • Structures possibles des oligomères


Propri t s de liaison du gtp par les oligom res
Propriétés de liaison du GTP par les oligomères nucléation des microtubules

Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif

 Des oligomères formés par association latérale de dimères

Affinité plus faible

Echange plus lent

 contraintes liées au pontage ?


M canisme de nucl ation des microtubules par les oligom res

nucléation des microtubulesExposant de nucléation

Concentration en microtubules

Mécanisme de nucléation des microtubules par les oligomères

Tubuline assemblée

Longueur moyenne des microtubules


Exposant de nucl ation
Exposant de nucléation nucléation des microtubules

 Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubule


Caract risation d un interm diaire de nucl ation
Caractérisation d’un intermédiaire de nucléation nucléation des microtubules

  • Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimères

    • 42 nm  environ 10 dimères

    • Taille + diffusion dynamique de la lumière  65% de tubuline sous forme oligomérique

  • Exposant de nucléation : environ 4

    • 4 oligomères se combinent pour former un microtubule  formation d’un feuillet ?

  • Les microtubules ne désassemblent pas spontanément

    • Absence de facteurs de catastrophes ?


Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
Plan nucléation des microtubules

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives



Partenaires de la tubuline
Partenaires de la tubuline nucléation des microtubules

  • Un nombre limité de partenaires

  • Des partenaires variables selon la nature des extraits


Prot ines identifi es
Protéines identifiées nucléation des microtubules

  • MAPs et moteurs MAP2, KIF21A

  • Protéines de la famille EB EB1, EB2

  • HSPs HSP70, HSP90

  • Enzymes du métabolisme Citrate lyase


Efficacit de la m thode
Efficacité de la méthode nucléation des microtubules

  • Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulaire

    • Identification toujours en cours

    • Utilisation d’extraits cellulaires humains (séquençage achevé)

    • Grande diversité d’extraits cellulaires possibles

  • Purification de partenaires interférant avec l ’assemblage

    • Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans l’assemblage

  • Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne

    • Identification d’effecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes


Instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs
Plan nucléation des microtubules

  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire

  • Objectifs

  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules

  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

  • Conclusions et perspectives


Conclusions
Conclusions nucléation des microtubules

  • Facteurs contrôlant l’assemblage des microtubules

    • Nucléation en deux étapes (oligomères ?)

    • Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubules

    • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophes

      • Facteurs de catastrophes = oligomères?

  • Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules

    • Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéré

    • Oligomères formés par association latérale d’environ 10 dimères

    • Environ 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule

  • Identification de partenaires de la tubuline

    • Des partenaires identifiés « qui font sens »

    • Identifications en cours


Perspectives
Perspectives nucléation des microtubules

  • Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelette

    • Mesure de l’activité sur la nucléation, l’élongation, le désassemblage

    • Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères

    • Recherche de facteurs de catastrophes

    • Réalisation d’un  « protéome » des partenaires de la tubuline

  • Transposition aux études cellulaires

    • Effet des oligomères de nucléation dans les cellules