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河南省胸科医院 中心实验室 张国龙

结核病免疫学诊断新进展. 河南省胸科医院 中心实验室 张国龙. March 24,2004,World TB day. Would you mind to clean this Dirty air by your lung?. 结核病人的全球分布. 结核菌形态学改变 正常结核菌. 细胞壁增厚.

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河南省胸科医院 中心实验室 张国龙

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Presentation Transcript

  1. 结核病免疫学诊断新进展 河南省胸科医院中心实验室张国龙

  2. March 24,2004,World TB day Would you mind to clean this Dirty air by your lung?

  3. 结核病人的全球分布

  4. 结核菌形态学改变 正常结核菌

  5. 细胞壁增厚 FIG. 1. Effect of anaerobic culture on the morphology of M.bovis BCG, M.tuberculosis, and M.smegmatis. (A) Longitudinal section of an M.bovis BCG bacillus cultured anaerobically for 6months showing pronounced cell wall thickening (some cytoplasmic dehydration is evident). (B) Transverse sections of M.bovis BCG bacilli cultured anaerobically for 6months. (C) Lack of cell wall thickening in low-OD aerobically cultured M.bovis BCG bacilli. (D) NLSPC M.bovis BCG bacilli showing the absence of cell wall thickening. (E and F) Cell wall thickening in M.tuberculosis following anaerobic culture for 1month under mineral oil. (G) Aerobically cultured M.smegmatis. (H) M.smegmatis bacilli exhibiting cell lysis following 35days of anaerobic culture.

  6. 细菌变小,呈颗粒状或椭圆状 37c,4 months without shaking in a loose caped Tube.

  7. 人体免疫

  8. 结核性肉牙肿模型

  9. ESAT-6抗原的研究开发 课题进展报告

  10. 一）课题立项背景和意义 课题２００２年８月立项，获 卫生人才科技创新项目经费资助 １５万元。

  11. 全球结核病疫情 感染人数2 ０亿 年新增加患病人数8００万 年结核病死亡人数２００万

  12. 中国结核病疫情 2000 全国流调感染率 44.5%， 结核患病率 367/10 万 涂阳患病率 122/10 万 估计全国有结核病人 ５００万TB，Average death age 55.2Y

  13. 结核病诊断的冰山现象 感染人群 活动性病人 总人口

  14. 大量病人的诊断需要依靠结素试验

  15. 存在的主要问题 １，PPD不能区分卡介苗接种和结核菌感染。 ２，我国卡介苗接种率超过９０％。 ３，存在有大量过诊过治现象TB，Average death age 55.2Y

  16. ９８年结核菌全基因测序的公布，为新诊断试剂的开发带来了希望！９８年结核菌全基因测序的公布，为新诊断试剂的开发带来了希望！

  17. BCG在传代过程中删除了ESAT-6等基因，也就意味着，用它作诊断试剂，可以排除卡介苗接种的干扰。BCG在传代过程中删除了ESAT-6等基因，也就意味着，用它作诊断试剂，可以排除卡介苗接种的干扰。 RD1区 ESAT-6 CFP10 TB BCG

  18. 二）课题已经取得的进展 一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。 二，动物实验 三，人体试验。

  19. 一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。 １，质粒构建 Vector;pQE30 Primer’ 5 -TTG GGA TCC ATG ACA GAG CAG-3 ; : 5 -ATA AAG CTT CTA TGC GAA CAT CC-3 . PCR ampliWcations were done with 35 cycles at 94 °C for 1min, 66 °C for 1min, and 72 °C for 1min, followed by a Wnal extension step at 72 °C for 2min, ESAT-6 基因插入

  20. 一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。 2，筛选克隆

  21. 一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。 3，大量培养转基因大肠杆菌 ３７度封闭式摇床

  22. 一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。 ４，蛋白分离与纯化系统 粉碎用硅酸粉 NI你NAT分离柱 P10纯化柱

  23. 一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。 ５，纯化出ESAT-6蛋白

  24. 一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。 ６，SDS蛋白表达确认 ESAT-6蛋白分子量约为６.５KD

  25. 二，动物实验 １，动物模型 小鼠品系；ICR 感染途径；H37Rv 或 BCG 104 CFU 尾缘静脉内注射 皮肤试验； 感染四周后， PPD 5u和ESAT-6蛋白2微克下肢脚垫内注射。以脚肿张直径为判断标准。

  26. 二，动物实验 ２，实验结果 ESAT-6在结核菌 和卡介苗感染组 皮试结果有明显差异。 10 H37Rv BCG 8 6 4 2 (mm) PPD ESAT-6 PPD ESAT-6

  27. 三，人体试验。 １，文献报道，活动性结核皮试结果和干扰素水平有正相关

  28. 三，人体试验。 2，外周血培养诱导干扰素实验操作程序

  29. 三，人体试验。 ３，志愿者皮试及外周血培养试验。 用于皮试结果 阳性率较低 PPD ESAT-6 PPD ESAT-6 皮试 干扰素测定

  30. 三，人体试验。 ２，志愿者皮试及外周血培养试验。 ４,PPD强阳患者中ESAT-6诱导 干扰素阳性率 PPD强阳性１０６例

  31. 四，研究结论 １，ESAT-6 不能用于皮肤试验，因为人体试验显示了较低的阳性率。（因为特异高，敏感性就低） ２，外周血培养，诱导干扰素实验，显示了良好的相关性。 ３，临床主要适用于菌阴结核病人的诊断。 ４，与PPD实验相比，可以缩短诊断时间，减轻病人 痛苦，提高正确诊断率。避免过诊过治。

  32. 三），课题的将来研究计划 １，课题以开发试剂盒为目的，为避免技术泄密，不提倡发表论文。 ２，继续扩大实验样本，稳定实验条件。 ３，ELISA试剂盒，存有成本高，价格贵的缺点，难以在基层推广。我们希望与其他单位 联合，进一步开发出操作简单，价格便宜的诊断试纸条。以便大面积推广使用。

  33. Study on Proinflammatory and Th1/Th2 Cytokines in Tuberculosis Cases ZHANG Guolong1,2 MITSUYAMA Masao2 DU Changmei1 SHI Ruiru1 WANG Jiangdong1 GAO Feixu1 XIE Hongge1 1 Henan Anti-Tuberculosis Institute, Zhengchou, Henan, China 2Department of Microbiology, Kyoto University School of Medicine, Japan

  34. BACKGROUND Cytokines produced by macrophages and T cells are believed to be involved in both pathophysiology and disease outcome in human tuberculosis. Among various cytokines, interferon gamma (IFN-g) appears to be the most essential one for the resolution of the disease. IFN-g production is under the control of IL-12 and IL-18 released from the cells of macrophage lineage. Th1/Th2 balance is believed to be important for the resolution of tuberculosis. Pneumonia,tuberculosis and tumor are three major diseases in lung,sometimes their x-ray shadows and symbols are quite similar,some cytokines might be useful for differential diagnosis The cytokine levels in the clinical specimen have not been examined well in China so far, and it appears to be useful to determine the levels of proinflammatory cytokines and Th1/Th2 cytokines in tuberculosis cases in China.

  35. RESULTS Cytokine levels in the sera of patients TB CANCER HEALTHY 2 区間移動平均(TB) 2 区間移動平均(CANCER) 2 区間移動平均(HEALTHY) 350.0 325.0 300.0 275.0 250.0 225.0 200.0 175.0 150.0 125.0 100.0 75.0 50.0 25.0 0.0 IL-8 TNF-a IL-12 IFN-g IL-18 IL-6 IL-8 TNF-a IL-12 IFN-g IL-18 IL-10 IL-4 IFN-g R IL-12R

  36. Pro-inflammatory cytokine levels in sera 140.0 120.0 100.0 cytokine level(pg/ml) 80.0 TB CANCER ** 60.0 HEALTHY 40.0 20.0 0.0 IL-6 IL-8 TNF-a

  37. Th1 type cytokines in the sera 700.0 600.0 500.0 TB ** 400.0 *** CANCER Cytokine level (pg/ml) 300.0 HEALTHY 200.0 100.0 0.0 IL-12 IFN-g IL-18

  38. IL-12 receptor and IFN-g receptor levels in the sera 450.0 400.0 350.0 300.0 TB ** 250.0 level(pg/ml) CANCER 200.0 HEALTHY 150.0 100.0 50.0 0.0 IFN-gR IL-12R

  39. Th2 cytokine levels in the sera *** *** *** *** * ** ***

  40. Comparison of cytokine levels between drug -resistant and -susceptible TB cases 700.0 DR TB 600.0 DS TB 500.0 400.0 ** 300.0 * 200.0 * 100.0 0.0 IL-6 IL-8 TNF-a IL-12 IFN-g IL-18 IL-10 IL-4 IFN- g R IL-12R-

  41. Comparison of cytokine levels between Smear-positive and -negative TB cases 700.0 600.0 500.0 ** 400.0 TB+ ** TB- 300.0 * 200.0 100.0 0.0 IL-6 IL-8 TNF-a IL-12 IFN-g IL-18 IL-10 IL-4 IFN- g R IL-12R

  42. Difference in the cytokine levels among different specimens 400.0 350.0 IL-6 IL-8 300.0 TNF-a 250.0 IL-12 Levels(pg/ml) 200.0 INF-g IL-18 150.0 IL-10 100.0 IL-4 50.0 INF-gR 0.0 IL-12R SERUM BALF FLUID CSF bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cerebrospinal fluid(CSF).

  43. Ratio of IL-10/TNF-a level in sera to assist differential diagnosis Sensitivity=30/32=93.8% Specificity=16/18=88.9%

  44. DISCUSSION NK Mast cell Tuberculosis immunity IL-2 Cellular TH1 immunity M f IFN- g IL-12,18 Competition effect T H0 TB bacterium IL-4 IL-4 Humoral TH2 immunity IL-5 IL-10

  45. 谢谢各位！

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