1 / 31

Eiwitzuivering 4

Eiwitzuivering 4. Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit Recovery en zuiveringsfactor Wat te doen met eiwitten?. TBEMH-P05IDB HC8. Sigrid Beiboer. Voorbeeld eiwitzuivering. Strategie eiwitzuivering, een voorbeeld. Inventarisatie van beschikbare gegevens:.

velika
Download Presentation

Eiwitzuivering 4

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Eiwitzuivering 4 Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit Recovery en zuiveringsfactor Wat te doen met eiwitten? TBEMH-P05IDB HC8 Sigrid Beiboer

  2. Voorbeeld eiwitzuivering

  3. Strategie eiwitzuivering, een voorbeeld Inventarisatie van beschikbare gegevens: • ppPLA2: porcine pancreatic phospholipase A2 • Gekloneerd in Escherichia coli als pro-enzym (proPLA2) • DNA en aminozuursequentie van proPLA2 is bekend • Mature enzym: 124 aminozuren, 14 kDa • Prosequentie: 7 aminozuren • pI bekend: 6,3 • Stabiel eiwit (7 zwavelbruggen): goed resistent tegen bevriezen, ontdooien, bewaren bij KT en pH 4-9 • Kristalstructuur is bekend • Enzymatische activiteit is bekend

  4. Structuur van PLA2

  5. Enzymatische activiteit van PLA2

  6. Schema eiwitzuivering van PLA2 uit E.coli bacteriecellen Homogenisatie + centrifugatie PLA2 in eiwitmengsel Centrifugatie Ionchromatografie (bij pH 4) Dialyse Ionchromatografie (bij pH 6) Dialyse FPLC + eiwitten

  7. Homogenisatie Triton X-100 toevoegen tot 0,1% eindconcentratie 10 L Kweek medium met bacteriecellen Centrifugeren Sonificatie (3*1 min op ijs) Bacteriecellen in 300 ml TE buffer (pH 8) + 75 gr. sucrose Centrifugeren Resuspenderen Pellet resuspenderen in 400 ml TE buffer 60 mg lysozym toevoegen Mengen, 30 min op ijs Sonificatie (1 min op ijs) 300 ml TE buffer toevoegen Centrifugeren Mengen, 30 min op ijs Pellet met inclusion bodies Sonificeren in 100 ml porties (3*90 sec op ijs)

  8. Hervouwing van proPLA2 • 7 M guanidine: pellet met inclusion bodies lost op • Thannhauser reagens sulfoneert eiwit (S-SO3-) • IJsazijn precipiteert eiwit • Centrifugatie en wassen van eiwit met water (2x) • 8 M ureum: gesulfoneerd eiwit lost op • 4 x verdunnen met buffer met cystine en cysteine: • 2 M ureum eindconcentratie, • hervouwing (o/n, 4ºC) • vorming juiste zwavelbruggen • Gerenatureerd proPLA2

  9. Activatie van PLA2 • CaCl2: PLA2 heeft Ca2+ nodig voor enzymactiviteit • pH instellen (8,3) • Trypsine: 5% (w/w) eindconcentratie (hoeveelheid proPLA2 geschat met SDS-PAGE) • Trypsine knipt prosequentie eraf en activeert PLA2 • PLA2 enzymactiviteit volgen met enzymbepaling • Geen toename enzym activiteit: • - pH naar 4,5 met ijsazijn • - trypsine inactief bij pH 4,5

  10. Activatie van PLA2 volgen met bepaling van enzymactiviteit Vrijgekomen vetzuur titreren met loog t = 2 t = 1 Loog (mmol) Enzymactiviteit t = 4 t = 3 Actief PLA2 Tijd (min.)

  11. Zuivering van PLA2 met ionchromatografie • Centrifugatie: verwijdering van geprecipiteerd eiwit • SP-Sephadex C25 bij pH 4 • kolom wassen met 4 kolom volumes NaAc • elutie PLA2 met zoutgradiënt (0 – 0,8 M NaCl) • Dialyse tegen 5 mM azijnzuur • CM-Cellulose bij pH 6 (elutie met 0 – 0,4 M NaCl)

  12. Zuivering met kolom chromatografie Fractieverzamelaar: • meet OD280 en geeft dit door aan recorder • verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft buiswisseling ook door aan recorder Eiwitoplossing in deze 2 buizen wordt verzameld en gedialyseerd OD280

  13. Activiteit Loog (mmol) mmol loog in 3 min Tijd (min.) t = 0 t = 3 min Stel, 20 ml zuiver PLA2 van 0,117 mg/ml (20 * 0,117 = 2,34 mg PLA2) Enzymbepaling met 300 l geeft 4,05 mol loog/min = 4,05 I.U. 4,05 / 0,3 = 13,5 I.U./ml Specifieke activiteit (S.A.): 13,5 / 0,117 = 115 I.U./mg Totale activiteit: 20 * 13,5 = 270 I.U.

  14. Internationale Units (IU) Definitie: 1 IU is die hoeveelheid enzym die in staat is om 1 mol/min substraat om te zetten of product kan vormen onder omschreven condities (pH, T, substraat, buffer) Vraag: Waarom IU en geen mol/l?

  15. Als je een enzymbepaling doet, dan • Moet [S].....? • Moet de pH.....? • Moet de temperatuur.........?

  16. Als je eenenzymreactiespectrometrisch wilt volgen, dan • Moet het substraat absorberen • Moet het product absorberen • Moeten het substraat en het product absorberen • Mogen het substraat en het product niet absorberen

  17. Vb. kwantificering zuiver ppPLA2 • Spectrofotometrisch OD280 • Meten tussen OD280 0,1 en 1 en blanco stellen met buffer • Tryptofaan, Tyrosine en in mindere mate phenylalanine en alle zwavelbruggen • 1 Trp 1*0,4 = 0,4 • 8 Tyr 8*0,1 = 0,8 • 5 Phe + 7 S-S = 0,1 • E1mg/ml 1,3 • OD280 = 0,78  0,78/1,3 = 0,60 mg/ml

  18. Zuivering en recovery • Recovery of yield: totale activiteit na bepaalde stap gedeeld door totale activiteit voor zuivering • Zuiveringsfactor: specifieke activiteit na bepaalde stap gedeeld door specifieke activiteit voor zuivering

  19. Per stap Totaal (begin – einde zuivering): - recovery = 45% - zuivering = 1500 En wat is de totale recovery na de eerste 3 zuiveringsstappen?

  20. Karakterisatie • Aminozuur sequentie • Drie dimensionale structuur : NMR, X-ray kristallografie • Massaspectrometrie • Stabiliteit (PLA2: toename tyrosine signaal bij hogere guanidine-HCl concentraties) • Biologische activiteit: - affiniteit - enzymactiviteit

  21. Ca2+ affiniteit van PLA2 KCa2+ (mM) S.A. (U/mg) 12,4 0,9 1,6 1,6 WT ( ) Mut ( )

  22. pH optimum van PLA2 pI PLA2 6,3 Mut 5,6 TAA is een onnatuurlijk aminozuur: - Lijkt erg op histidine - pKa (TAA) is 4 eenheden lager dan pKa (His) TAA: 1,2,4-triazole-3-alanine

  23. Interface activering van PLA2 Micelvorming: - voldoende substraat - detergens toevoegen

  24. Massaspectrometrie • Ionisatie moleculen in gasfase • Versnelling ionen in elektrisch veld • Scheiding ionen op basis van hun massa/ladingsverhouding • Detectie • Snel (steeds meer gebruikt, mn ziekenhuizen) • Nauwkeurig (dalton)

  25. Bepaling van de ruimtelijke structuur • NMR • X-ray kristallografie • Modelling: homologie (sequentie of functie domein) zoeken met eiwitten van bekende structuur Lactalbumin Lysozyme

  26. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy • Atoomkernen van sommige isotopen hebben magnetische momenten • Deze is afhankelijk van omgeving • Gebruik: - eiwitstructuur bepaling - volgen metabolisme (ziekenhuizen)

  27. X-ray kristallografie

  28. Protein engineering

  29. Protein engineering bij Genencor, Leiden Beste eigenschappen van 2 soortgelijke eiwitten combineren Voorbeeld: alpha amylases met verhoogde stabiliteit, veranderde calcium-bindende eigenschappen en verbeterde werking bij lage pH.

  30. Proteomics in drug discovery

  31. Biochemistry vs. Proteomics

More Related