1 / 88

ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ – ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ – ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ. ΚΑΛΗ Γ. ΜΑΚΕΔΟΥ Ιατρός Βιοπαθολόγος Διδάκτορας Α.Π.Θ. Επιστημονική Συνεργάτης Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ. 1937: Arne Tiselius apparatus (υγρό μέσο). 1950: Ηλεκτροφόρηση ζώνης (στερεό ή gel).

vega
Download Presentation

ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ – ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ – ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΛΗ Γ. ΜΑΚΕΔΟΥ Ιατρός Βιοπαθολόγος Διδάκτορας Α.Π.Θ. Επιστημονική Συνεργάτης Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ.

  2. ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 1937: Arne Tiselius apparatus (υγρό μέσο) 1950: Ηλεκτροφόρηση ζώνης (στερεό ή gel)

  3. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ • Είναι μια μορφή χρωματογραφίας • Βασίζεται στη μετακίνηση φορτισμένων μορίων κάτω από την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου. • Οι χημικές ενώσεις που φέρουν φορτίο λόγω ιοντισμού μετακινούνται, ανάλογα με το είδος του φορτίου, προς την άνοδο (θετικό πόλο) ή προς την κάθοδο (αρνητικό πόλο). • Εφαρμόζεται • στο διαχωρισμό μακρομορίων, π.χ. πρωτεϊνών, λιποπρωτεϊνών, DNA και RNA, και οργανικών ουσιών • στον έλεγχο της καθαρότητας δείγματος • ποσοτικό και ποιοτικό έλεγχο • προσδιορισμό ΜΒ

  4. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ • Οι πρωτεΐνες έχουν αρνητικό ή θετικό ολικό φορτίο ανάλογα με το pH(αμφολυτικές ιδιότητες). • ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ: pΗστο οποίο το ολικό φορτίο είναι ουδέτερο. • Ο διαχωρισμός πρωτεϊνών γίνεται με την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα.

  5. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ U = Ez / f • U = ταχύτητα μετακίνησης μορίου σε ηλεκτρικό πεδίο • Ε = ένταση του ηλεκτρικού πεδίου • z = καθαρό φορτίο του μορίου • f = συντελεστή τριβής (εξαρτάται από μάζα και σχήμα μορίου και από πυκνότητα του μέσου) • Ez = ηλεκτροστατική δύναμη που οδηγεί το μόριο

  6. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ μ = Q / k. r. n • Ηλεκτροφορητική κινητικότητα (μ) • Ανάλογη με το φορτίο του μορίου (Q) • Αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθός του (r) και τη γλοιότητα του διαλύματος (n)

  7. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΣΥΣΚΕΥΗ

  8. ΚΥΡΙΕΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ • Ηλεκτροφόρηση Ζώνης (zone electrophoresis, ZE) • Ισοταχής ηλετροφόρηση (Isotachophoresis, ITP) • Ισοηλεκτρικός εστιασμός (Isoelectric focusing)

  9. Α. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ

  10. ΜΕΣΟ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ • Χαρτί(Paper electrophoresis) • Οξική κυτταρίνη(Cellulose acetate electrophoresis) • Τριχοειδής σωλήνας (Capillary electrophoresis) • Πηκτές (gels) – πορώδη υλικά • Αγαρόζης (Agarose electrophoresis) • Πολυακρυλαμίδης (PAGE) • Με αποδιάταξη –απώλεια τεταρτοταγούς δομής (SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate) • Χωρίς αποδιάταξη (native PAGE) • Δύο διαστάσεων (2D-electrophoresis)

  11. ΠΗΚΤΕΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ • Εύκολος χειρισμός • Φυσικό και όχι χημικό περιβάλλον για το δείγμα • Εύκολος χειρισμός του δείγματος • Μπορεί να αποθηκευτεί το gel (4οC) • Όσο μεγαλύτερη η πυκνότητα τόσο μικρότερα μακρομόρια διαχωρίζονται (0,6 – 3%) • Συνήθως χρησιμοποιείται 1% ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • Ηλεκτροφόρηση μεγάλων μορίων DNA • Ηλεκτροφόρησηπρωτεϊνών ΜΒ>200kDa,λόγω μη ομοιογενών πόρων

  12. ΠΗΚΤΕΣ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΚΑΙ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ (PAGE) • Ομοιόμορφοι πόροι • ΠΡΟΣΟΧΗ Η ακρυλαμίδη είναι νευροτοξίνη ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • ΗλεκτροφόρησηπρωτεϊνώνMB 5-2000kDa για • Διαχωρισμό πρωτεϊνών • Διαχωρισμό ισομορφών πρωτεϊνών • Ηλεκτροφόρησημικρών μορίων DNAή RNA και ολιγονουκλεοτιδίων • Πυκνότητες 6%, 8%, 10%, 12%, 15%

  13. ΠΗΚΤΕΣ • Αποδιάταξης (denaturating) • SDS (Sodium dodecyl sulfate): Αποδιατάσσει την πρωτεΐνη • Χωρίς αποδιάταξη (native) • Χρήση στην πρωτεωμική • Μελέτη τεταρτοταγούς δομής πρωτεΐνης • Οπτικοποίηση όχι μόνο με χρώσεις αλλά και με μεθόδους ανοσολογικές

  14. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΦΟΡΤΙΣΗΣ(Loading buffers) • Bromophenol blue • Cresol Red • Orange G

  15. ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ • Ρόλος: • Μεταφορά ρεύματος • Διατήρηση του pH σταθερού • Είδη: • Βαρβιτουρικά • Tris (τρις υδροξυλαμινομεθάνιο) • Tris/Acetate/EDTA • Tris/Borate/EDTA • pH = 8,8

  16. ΟΠΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ • Χρώσεις • Coomassie Brilliant Blue (έως 30 ng) • Colloidal Coomassie Blue (έως 10 ng) • Zinc-imidazole(έως 2 ng) • Silver stain (έως 2 ng) • SYPRO Ruby (έως 1 ng) • Oil Red O • Sudan Black B

  17. ΟΠΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ • Πυκνόμετρο σάρωσης (scanning densitometer) – για ποσοστιαία αναλογία κλασμάτων • Ανάγνωση σε UV • Blotting(π.χ. Western) • Ανάλυση με φασματογράφο μάζας

  18. ΤΥΠΟΙ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ

  19. 1.ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΧΑΡΤΙ • Στο παρελθόν χρήση για λευκώματα ορού • Πλεονεκτήματα: • Υψηλή αντοχή υλικού • Χαμηλό κόστος • Ευκολία χρήσης • Μειονεκτήματα: • Διάρκεια 14 – 16 ώρες • Χαμηλή διακριτική ικανότητα

  20. 2. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΟΞΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ • Αποτελούσε μέθοδο εκλογής για διαχωρισμό πρωτεϊνών • Αντιδρά η κυτταρίνη (-ΟΗ) με οξικό ανυδρίτη • Σε ξηρά μορφή – μεμβράνες εύθρυπτες και λευκές • Προηγείται ενυδάτωση πριν τη χρήση με το ρυθμιστικό διάλυμα • Ακολουθεί • Χρώση • Μονιμοποίηση και έκπλυση με οξικό οξύ 5% • Αφυδάτωση με μεθανόλη • Διαύγαση με μεθανόλη 95% και οξικό οξύ 5%

  21. 3. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • ΚΥΡΙΩΣ για το διαχωρισμό DNA και RNA • Καθαρισμό / απομόνωση τμημάτων DNA μετά την επίδραση περιοριστικών ενζύμων • Ανάλυση προϊόντων PCR • Ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό DNA

  22. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ DNA ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ

  23. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ

  24. ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ Χωρίς UV Με UV

  25. B. ΙΣΟΤΑΧΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  26. ΙΣΟΤΑΧΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ(Isotachophoresis) • Μετεξέλιξη της ηλετροφόρησης • Διαχωρισμός φορτισμένων σωματιδίων με τη χρήση μη συνεχούς ηλεκτρικού πεδίου. • Το δείγμα εισάγεται ανάμεσα σε • ένα ταχύ ηλεκτρολύτη (χαμηλό ηλεκτρικό πεδίο) • ένα πιο αργό τελικό ηλεκτρολύτη (υψηλό ηλεκτρικό πεδίο) • Εφαρμογή στην SDS-PAGE με δύο buffer και δύο gel

  27. 4. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑ - ΜΑΡΤΥΡΑΣ • SDS: Sodium dodecyl sulfate • Bromophenol blue • Θέρμανση ΠΗΚΤΗ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ (5 – 25%) • Ακρυλαμίδιο - πολυμερισμός • SDS ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ (BUFFER)

  28. 4. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  29. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • ΚΥΡΙΩΣ ηλεκτροφόρηση μικρών πρωτεϊνών, χωρίς να μπορεί να μελετηθεί η τεταρτοταγής δομή των πρωτεϊνών • Ηλεκτροφόρηση μικρών μορίων DNA ή RNA και ολιγονουκλεοτιδίων

  30. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  31. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  32. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  33. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  34. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  35. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  36. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

  37. 5. NATIVE PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ • Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα δεν εξαρτάται μόνο από το φορτίο και τη μάζα, αλλά και από το φυσικόσχήμα και μέγεθος της πρωτεΐνης • Blue native (BN) • Clear native (CN) • Quantitative Preparative Native Continuous PAGE (QPNC-PAGE) –

  38. BLUE NATIVE PAGE (BN) • Η Coomassie Brilliant Blue φορτίζει τις πρωτεΐνες. • Λειτουργεί σαν αποδιατακτικό μέσο CLEAR NATIVE PAGE (CN) • Δεν υπάρχει χρωστική να φορτίσει τις πρωτεΐνες, • Κινούνται μόνο βάσει του φορτίου που αποκτούν μέσα στο buffer

  39. QUANTITATIVE PREPARATIVE NATIVE PAGE (QPNC-PAGE) • Το buffer με pH 10,0 κινεί τις πρωτεΐνες. • Τα κλάσματα εκλούονται σε pH 8,0 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • Προσδιορισμός συμπαραγόντων, π.χ. Fe, Cu, Zn, κλπ • Ποσοτικός Προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνών

  40. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ • ΧΡΩΣΗ με • Coomasie Brilliant Blue ή • Silver • ΑΠΟΤΥΠΩΣΗ (WESTERN) γιατί • Δεν μπορεί να αποθηκευτεί η πηκτή • Πρέπει να ταυτοποιηθούν οι πρωτεΐνες

  41. WESTERN BLOTTING • Ακολουθεί ανίχνευση • ενζυμοανοσολογικά (Immunoblotting) • ραδιονοσολογικά • με χημειοφωταύγεια

  42. WESTERN BLOTTING

  43. ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ(IMMUNOFIXATION ELECTROPHORESIS, IFE) Καθίζηση ανοσοσυμπλεγμάτων – Ανίχνευση μονοκλωνικώνAbs ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ • Μετά από εύρεση παθολογικών τιμών λευκωμάτων στον ορό • Παρουσία λοίμωξης • Διευρεύνηση πιθανού πολλαπλού μυελώματος ή υποτροπιαζουσών λοιμώξεων ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗΣ • Όταν βρεθεί παθολογική «ζώνη» μονοκλωνικήςανοσοσφαιρίνης στην ηλεκτροφόρηση

  44. 6. ΤΡΙΧΟΕΙΔΙΚΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ(Capillary electrophoresis) • Ηλεκτροφορητικό μέσο: υγρό - ηλεκτρολύτης • Εφαρμογή : Διαχωρισμός ιόντωνή νουκλεοτιδίων βάσει φορτίου • Οπτικοποίηση: UV, φθορισμό, φασματογράφο μάζας

  45. 6. ΤΡΙΧΟΕΙΔΙΚΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ(Capillary electrophoresis)

More Related