食品微生物检验方法

1. 食品微生物检验方法

2. 内容提要 • 菌落总数检测 • 大肠菌群及大肠杆菌检测 • 金黄色葡萄球菌检测 • 沙门氏菌检测 • 单核细胞增生李斯特氏菌检测

3. 菌落总数测定——菌落总数的概念 • 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。

4. 菌落总数测定——卫生学意义 • 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 • 及时反映食品加工过程是否符合 卫生要求，为被检食品卫生学评 价提供依据。 • 通常认为，食品中细菌数量越多， 则可考虑致病菌污染的可能性越 大，菌落总数的多少在一定程度 上标志着食品卫生质量的优劣。

5. FDA BAM 菌落总数测定流程 检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品 选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA） 35 ℃ ，48 ± 2h 菌落计数

6. FDA BAM 菌落计数方法 • 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下： N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d • 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count • 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。 • 所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。 • 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。 • 最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。

7. ISO4833-2003 菌落总数测定流程 检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品 选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量（12~15mL） 平板计数琼脂（PCA）， 30±1 ℃ ，72 ±3 h 菌落计数 如果怀疑样品中含有在培养基表面蔓延生长的菌落，待琼脂凝固后，在其上覆盖一层（4mL）水琼脂。 平板叠放不超过6个

8. ISO4833-2003菌落计数方法 • 选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下： N=∑C/（n1+0.1*n2）*d • 所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE=m 固体样品： NE=m×d-1 • 无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 ×d-1 • 最终结果保留前两位有效数字。

9. 菌落总数测定几点说明 • 由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。 • 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。

10. 菌落总数测定几点要求 • 每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。 • 检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。 • 检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃放置，以便在计数检样时用作对照。

11. 大肠菌群的定义 • 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 • 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。

12. 大肠杆菌的定义 • 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 • 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。 • 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。

13. 大肠菌群和大肠杆菌的关系 耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 ℃ 培养48h产酸产气，并在44.5℃培养24h产酸产气的细菌（依据ISO标准）

14. 卫生学意义 • 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 • 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 • 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。

15. 大肠杆菌的生物学特性 基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

16. 大肠杆菌的生物学特性 培养特性： • 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。 • 在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。

17. 大肠菌群及大肠杆菌测定——MPN法检验流程（FDA BAM） 检样50g+450ml稀释液 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管）， 每管接种1mL 35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h 没有产气管 有产气管 报告阴性 接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤 35 ± ℃ ，48 ± 2h 44.5±0.5 ℃ （水浴培养） 24 ± 2h ~48 ± 2h 查MPN表报告结果 产气管接种EMB平板（35℃、18~24h） （大肠菌群） 从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 种LST复检产气 查MPN表报告结果（大肠杆菌）

18. 大肠菌群测定——MPN法检验几点说明 • MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 • 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。 • 产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

19. 大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别 EMB平板典型大肠杆 菌菌落特征： 中心黑色或紫红色，有 或无绿色金属光泽

20. 大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别 • EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长； • 高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀； • 大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽； • 该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。

21. 大肠杆菌测定——革兰氏染色 基本原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。 革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。

22. 大肠杆菌测定——革兰氏染色 Gram negative Gram positive Gram straining

23. 大肠杆菌测定——革兰氏染色 基本步骤： • 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗； • 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗； • 滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗； • 滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。 • 结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

24. 大肠杆菌测定——生化鉴定

25. I M Vi C生化试验

26. 金黄色葡萄球菌——概述 • 根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。 • 金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。

27. 金黄色葡萄球菌——生物学特性 金黄色葡萄球菌呈球形，直 径0.8μm左右，排列成葡萄 串状 ，无芽孢，无荚膜。 革兰氏染色阳性，但衰老、 死亡或被白细胞吞噬的菌体， 常呈革兰氏阴性。

28. 金黄色葡萄球菌——生长特性 • 金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。 • 血平板上金黄色葡萄球菌呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。 • Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌圆形突起、光滑、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。

29. 金黄色葡萄球菌检验——方法适用性 • MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。 • 直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品。 • 增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。 定量方法 定性方法

30. 金黄色葡萄球菌检验——直接平板计数法 检样（50g+450mL稀释液） 适当十倍稀释样品 选择2~3个连续适宜稀释度 吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于 3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验） 35℃ ，45~48 h 确证试验 报告 或涂布于1块140mm平板上

31. FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验——MPN法 检样（50g+450mL稀释液） 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管10% NaCl TSB肉汤， 每管接种1mL 35℃ ，48 ±2 h 从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上 35℃ ，48 h 确证试验 报告 含1%丙酮酸钠

32. FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验 1.凝固酶试验 • 方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35℃培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置35℃培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h。 试验中需同时做已知阳性和阴性对照。 • 结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和3+）的必须进行生化鉴定加以证实。

33. FDA BAM金黄色葡萄球菌确证试验 2.革兰氏染色 • 对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。 3.生化鉴定 • 过氧化氢酶试验 • 葡萄糖厌氧利用试验 • 甘露醇厌氧利用试验 • 金葡溶菌酶敏感性试验 • 耐热核酸酶试验（辅助） Staphylococcusaureus on DNase Agar

34. FDA BAM 2种葡萄球菌和微球菌的典型特性

35. ISO 金黄色葡萄球菌检验——MPN法 接种10mL 于10mL双料肉汤，接种1mL 于9mL单料肉汤。 检样（xg+9xmL稀释液） 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管 modified Giolitti and Cantoni broth， 37℃ ，24~48 h 从变黑或出现黑色沉淀的管中 接种1环培养物于 Baird-Parker平板上 37℃ ，48 h 确证试验 报告 小心的于接种管中培养基顶部倾注一定量的水琼脂，使其凝固形成密封塞。

36. ISO 金黄色葡萄球菌确证试验 凝固酶试验 • 结果判定： - 1+ 2+ 3+ 4+ negative positive

37. 沙门氏菌属简介 • 1880年E. Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。 • 沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。

38. 沙门氏菌属——生物学特性 形态特征： 革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。

39. 沙门氏菌属——生物学特性 培养特性： • 沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 ℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8~7.8。 • 营养琼脂平板上：35~37℃培养18~24h，其菌落大小一般为2~3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。 • 血平板上：中等大小的灰白色菌落。 生化特性： • 绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。

40. 沙门氏菌属的抗原 • 菌体抗原（O抗原） • 表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原 • 鞭毛抗原（H抗原） • 纤毛抗原

41. FDA BAM沙门氏菌检验流程 前增菌25g样+225mL乳糖肉汤 （肉制品、肉副产品、动物产品） 匀质2min，室温放置60 ±5min 混合均匀，测定调节PH6.8 ±0.2 35℃、24 ± 2h 选择性增菌 0.1ml+10mlMM（RV）1ml+10mlTTB 42℃、24h （水浴培养）35℃、24h 43℃、24h（水浴培养） 含菌量高 含菌量低 分离培养 划线接种 选择性培养基（BS、XLD、HE） 35℃、24~48h（BS） 生化鉴定 每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个） 接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm） （松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S） 35℃、24±2h 弃去 尿素酶试验 卫矛醇、 氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验 阳性阴性 血清学 血清学试验——沙门氏菌的分类 报告结果 生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料

42. ISO6579沙门氏菌检验流程 前增菌25g样+225mLBPW 匀质 37±1℃、18 ± 2h 选择性增菌 0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn 41.5 ± 1℃、24 ± 3h 37 ± 1℃、24 ± 3h （水浴培养） 分离培养 划线接种选择性培养基（XLD和第二种选择性培养基，如 BS） 37℃、24~48h（BS） 每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培养和确认试验 37℃、24±3h 生化鉴定TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、β-牛乳糖、V-P、 吲哚试验 血清学 血清学试验——沙门氏菌的分类 报告结果

43. ISO6579沙门氏菌生化试验表

44. XLD琼脂： FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈 现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。 ——非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。 ISO——中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。 沙门氏菌检验选择性分离培养

45. BS琼脂： FDA BAM——典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周 围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而 变为黑色，并有晕环效应； ——非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养 基不变色。 沙门氏菌检验选择性分离培养 Blank 50115 50071 44104

46. HE琼脂： FDA BAM——典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色 中心或几乎全黑色。 ——非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。 沙门氏菌检验选择性分离培养

47. TSI： 典型反应：斜面产碱（K）：红色； 底部产酸（A）：黄色； 产H2S：黑色（少数不产） 沙门氏菌检验生化鉴定

48. 沙门氏菌检验——几点注意 • 冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。 • 为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。 • 进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。 • 测试中应同时接种阳性对照菌株。

49. 李斯特菌属简介 • 《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版中，李斯特菌属有7个种：单核细胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua） 、西尔李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威尔斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、绵羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。 • 单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人的感染。

50. 单核细胞增生李斯特氏菌——生物学特性 形态特征： 革兰氏阳性短杆菌，大小为0.4~0.5×0.5~2μm， 两端钝圆，常两两相串成弯曲及V形，偶尔有球状、双球状、短链状，但很少有长链状，兼性厌氧、无芽孢，一般不形成荚膜。该菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脱落。20℃培养后可见到很多鞭毛。