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真核基因表达调控相关概念和一般规律 真核基因表达的转录水平调控 真核基因表达的染色质修饰和表观遗传调控 基因沉默对真核基因表达的调控 真核基因其他水平上的表达调控

真核基因表达调控相关概念和一般规律 真核基因表达的转录水平调控 真核基因表达的染色质修饰和表观遗传调控 基因沉默对真核基因表达的调控 真核基因其他水平上的表达调控. Contents. 2. 目录 相关概念 干扰小RNA miRNA. 基因沉默. 又称RNA沉默，RNA silencing 真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除 细胞中非正常RNA的一种机制 分类 转录水平基因沉默 转录后基因沉默. RNA干扰. 双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性 降解的技术 可以特异性降低或关闭基因的表达 应用 探索基因功能 疾病的基因治疗.

vanida
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真核基因表达调控相关概念和一般规律 真核基因表达的转录水平调控 真核基因表达的染色质修饰和表观遗传调控 基因沉默对真核基因表达的调控 真核基因其他水平上的表达调控

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Presentation Transcript

  1. 真核基因表达调控相关概念和一般规律 真核基因表达的转录水平调控 真核基因表达的染色质修饰和表观遗传调控 基因沉默对真核基因表达的调控 真核基因其他水平上的表达调控 Contents

  2. 2 目录 相关概念 干扰小RNA miRNA

  3. 基因沉默 又称RNA沉默，RNAsilencing 真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除 细胞中非正常RNA的一种机制 分类 转录水平基因沉默 转录后基因沉默

  4. RNA干扰 双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性 降解的技术 可以特异性降低或关闭基因的表达 应用 探索基因功能 疾病的基因治疗

  5. 5 目录 相关概念 干扰小RNA 干扰小RNA的发现 siRNA的生物合成 siRNA介导的沉默机理 siRNA的生物学意义 miRNA

  6. 干扰小RNA的发现 1990年Jorgensen研究小组要得到颜色更 深的牵牛花，转入相应的查尔酮合成酶的基 因，最终合成酶的量反而减少，牵牛花颜色 变浅

  7. 7 干扰小RNA的发现 1992年，罗马诺（Romano）和Macino 也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以 抑制具有同源序列的内源基因的表达。 1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发 现了RNA干扰现象。

  8. 干扰小RNA的发现 1998年，安德鲁·法厄（AndrewZ.Fire） 等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反 义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双 链RNA相比反义RNA显示出了更强的抑制效 果

  9. 9 双链RNA的抑制效果比反义RNA强 a.正常胚胎，无杂交探针 b.未注射RNA，杂交探针检测內源MEX3RNA c.注射MEX3RNA反义链，杂交显示MEX3RNA水平略有下降 d.注射双链MEX3RNA, 杂交探针未检测出內源MEX3RNA

  10. 干扰小RNA的发现 安德鲁·法厄（AndrewZ.Fire）等推测在 双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效 应并且有某种酶活性参与其中。 并且将这种现象命名为RNA干扰。 2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛 （CraigC.Mello）由于在RNAi机制研究中 的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。

  11. 干扰小RNA的发现 双链RNA沉默效率远高于单链RNA，说明 沉默过程中可能需要形成配对 外源RNA的链会被切成21-23nt的小片段， 说明降解过程可能是由这些小片段介导的 介导基因沉默现象的小片段RNA称为干扰 小RNA

  12. 5 目录 相关概念 干扰小RNA 干扰小RNA的发现 siRNA的生物合成 siRNA介导的沉默机理 siRNA的生物学意义 miRNA

  13. siRNA的生物合成 siRNA的来源 病毒RNA 环境、实验因素引入的外源RNA 基因组重复片段 转座子序列

  14. siRNA的生物合成 siRNA的组成 长度21nt 19nt配对形成双链 3’端各有两个不配对核苷酸 5’端磷酸基团 一条链为引导链，介导mRNA的降解 另一条链为乘客链，在siRNA形成有功能的复 合物前被降解

  15. siRNA的生物合成

  16. 15 siRNA的产生过程 经Dicer切割形成双链小片段 组装复合物 形成有活性的沉默复合物RISC

  17. 17 Dicer切割

  18. 16 Dicer切割 Dicer包括一对RNaseIII结构域， 双链RNA结合域，解旋酶结构域 和PAZ结构域 PAZ结构域可以结合dsRNA的两 个3’不配对核苷酸 两个RNaseIII结构域形成分子内 二聚体结构，各催化剪切一条链， 产生双链断裂 6.5nm长度等同二十多个核苷 酸的长度 Dicer作为裁剪的尺子，切出21- 23nt的siRNA

  19. R2D2的装配 R2D2 双链RNA结合蛋白 包括两个一前一后的双链RNA结合结构域 常结合在引导链3’端一侧 Dicer和R2D2形成二聚体 Dicer/R2D2/siRNA三者形成RISC装载复合物 R2D2招募Argonaute蛋白，开始组装RISC

  20. RISC的装配和成熟

  21. 19 RISC的装配和成熟 Argonaute和Dicer交换，结合到siRNA双 链的一端 Argonaute与R2D2交换，将整个双链 RNA都转载到Argonaute中 Argonaute将乘客链降解，形成有功能的 沉默复合物

  22. 20 RISC的装配和成熟 Argonaute蛋白的结构域 PAZ，与Dicer中PAZ功能相同，结合RNA分子 的3’端不配对的两个核苷酸 MID，结合siRNA的5’端，作用时需要二价阳 离子（镁离子）的参与 PIWI,三级结构与RNaseH家族蛋白的核心结 构相似，可催化剪切RNA

  23. RISC的装配和成熟 Structural biology: Tracing Argonaute binding Samir Bouasker & Martin J. Simard Nature 461, 743-744(8 October 2009) doi:10.1038/461743a

  24. 5 目录 相关概念 干扰小RNA 干扰小RNA的发现 siRNA的生物合成 siRNA介导的沉默机理 siRNA的生物学意义 miRNA

  25. siRNA介导的沉默机理 两个水平上的沉默 转录后水平的mRNA的降解 染色体水平上形成异染色体

  26. siRNA介导的基因沉默 靶mRNA可以被siRNA切割成若干片段， 片段之间往往长度差为21-23nt 切割出的片段长度由siRNA与mRNA的那段 碱基互补配对决定 siRNA介导的mRNA的降解需要核酸酶的 催化和镁离子的帮助

  27. siRNA介导的基因沉默 装配好的RISC中，siRNA引导链的5’端与 Argonaute蛋白的MID结合，3’端与其 PAZ结合 PIWI PAZ siRNA引导链 MID

  28. siRNA介导的基因沉默 siRNA的第2-8个核苷酸与靶mRNA特异性配对， 位于PIWI功能域，切割往往发生在第9-10个氨基 酸上，由PIWI催化将靶mRNA切断，被切断的 mRNA离开RISC PIWI

  29. siRNA的放大效应 RNA依赖的RNA聚合酶RDRP 能够扩增siRNA 产生siRNA放大效应 在植物、线虫和酵母中都存在以RNA为模 板的RNA扩增机制，但在哺乳动物和果蝇 的基因组中没有相关基因

  30. siRNA的放大效应 siRNA作为扩增的引物，以mRNA为模板 合成双链RNA，产生新的RISC，新扩增产 生的各种次级siRNA可以与靶mRNA的不同 区域配对，更大范围地降解靶mRNA 植物中，次级siRNA可以传递到其它细胞 中，甚至在不同组织间广泛传播

  31. 机体清除错误mRNA的机制 成熟的真核mRNA与各种蛋白质结合，使 得RDRP无法靠近 当细胞的mRNA中缺少RNA结合蛋白时 （错误的mRNA也存在这种情况），RDRP 可以结合mRNA并以其作为模板扩增出双链 RNA，经Dicer切割等步骤产生siRNA，来 降解內源RNA

  32. siRNA介导的沉默机理 两个水平上的沉默 转录后水平的mRNA的降解 染色体水平上形成异染色体

  33. siRNA介导的异染色质形成 异染色质区域和转座子区，容易通过上述 方法产生相互配对的siRNA siRNA通过RNA-蛋白质，蛋白质-蛋白质 相互作用，将组蛋白甲基转移酶募集到染色 质的相应区域，使异染色质化标签位点的 H3K9被甲基化修饰

  34. siRNA介导的异染色质形成 siRNA介导的组蛋白甲基化、DNA甲基化 将导致相应区域的异染色质化或基因沉默 这种机制可以阻抑不必要基因和有害基因 的表达，对维护基因组的稳定非常重要

  35. siRNA介导的沉默机理 转录后水平的mRNA的降解 染色体水平上形成异染色体 Transposable elements and the epigenetic regulation of the genome R. Keith Slotkin and Robert Martienssen Nature Reviews Genetics 8, 272-285 (April 2007) doi:10.1038/nrg2072

  36. 5 目录 相关概念 干扰小RNA 干扰小RNA的发现 siRNA的生物合成 siRNA介导的沉默机理 siRNA的生物学意义 miRNA

  37. siRNA的生物学意义 在转录水平、转录后水平参与基因的表达 调控 维持基因组的稳定 保护基因组免受外源核酸侵入

  38. 34 入侵病毒和宿主在siRNA上的竞争 宿主可以病毒RNA为模板，通过RDRP合 成病毒的双链RNA，经过Dicer切割组装成 RISC，降解病毒RNA，从而抑制病毒对宿 主细胞的破坏；同时siRNA的传递让其它组 织提前具有抗病毒的能力 病毒也进化出类似系统，对抗宿主抗病基 因的mRNA，这种siRNA也会在宿主体内传 播，增加了未被侵染的细胞的易感性

  39. 目录 相关概念 干扰小RNA miRNA miRNA的发现 miRNA的生物合成 miRNA的选择性装载 miRNA的功能

  40. 36 miRNA的发现 1993年Lee，Feinbaum和Ambros等人发现 在线虫体内存在一种RNA（lin-4），是一种不 编码蛋白，但能够负调控LIN-14蛋白 lin-4基因转录物形成一大一小两个片段 Lin-4L61nt Lin-4S22nt是真正起作用的miRNA lin-4S和lin-14的mRNA的3’UTR的重复序 列互补，从而实现了lin-4对lin-14的转录后调 控

  41. 37 miRNA的发现 microRNAlet-7 编码21nt的microRNA 与多个不同发育时期表达的mRNA的3’UTR 区域互补：lin-14,lin-28,lin-41,lin-42等 机制与lin-4相似

  42. 目录 相关概念 干扰小RNA miRNA miRNA的发现 miRNA的生物合成 miRNA的选择性装载 miRNA的功能

  43. miRNA的生物合成

  44. 39 miRNA的生物合成 miRNA的初级转录产物pri-miRNA 5’加帽 3’有polyA结构 miRNA 也由RNApolyII转录 有自己的启动子区 表达会受到各种时空上的调控

  45. 40 miRNA的生物合成 RNA聚合酶II产生较长的pri-miRNA 第一步切割产生pre-miRNA 第二步切割产生双链miRNA，双链 miRNA解链形成成熟的长21nt左右的单链 miRNA

  46. 第一次切割 需要RNaseIII和双链RNA结合蛋白 Drosha是一种RNaseIII，将pri-miRNA的3’端 和5’端切割产生长约70nt的pre-miRNA，保留 茎环结构 Drosha的正确切割需要双链RNA结合蛋白，在哺 乳动物中为DGCR8蛋白

  47. 42 第二次切割 pre-miRNA经 Exportin5/RanGTP运出细胞 核进入细胞质基质中 细胞质基质中Dicer切割pre- miRNA茎环结构环的一端形成 长约21nt的dsmiRNA，其中 一条链是最终的成熟miRNA链

  48. 目录 相关概念 干扰小RNA miRNA miRNA的发现 miRNA的生物合成 miRNA的选择性装载 miRNA的功能

  49. 44 miRNA的选择性装载 单链miRNA可以装载在RISC中介导转录后沉默 RISC的装载依赖于AGO蛋白 大部分AGO蛋白倾向于结合5’端为U或A的 miRNA

  50. 目录 相关概念 干扰小RNA miRNA miRNA的发现 miRNA的生物合成 miRNA的选择性装载 miRNA的功能

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