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实验五 动物组织中核酸（ DNA 和 RNA ）分离鉴定

实验五 动物组织中核酸（ DNA 和 RNA ）分离鉴定. 目的要求. 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术； 学习测定 DNA/RNA 含量的基本原理及具体方法。. 核酸分离、纯化原则. ① 保持核酸分子一级结构的完整性 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式 。 ②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染； ③无杂核酸分子的污染（如纯化 DNA 分子时应 去除 RNA 分子）。. 实验仪器. 玻璃匀浆器 解剖器 显微镜 恒温水浴 离心机 TU1901- 紫外分光光度计 电炉.

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实验五 动物组织中核酸（ DNA 和 RNA ）分离鉴定

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  1. 实验五 动物组织中核酸（DNA和RNA）分离鉴定

  2. 目的要求 • 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术； • 学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。

  3. 核酸分离、纯化原则 • ①保持核酸分子一级结构的完整性 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 • ②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染； • ③无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应 去除RNA分子）。

  4. 实验仪器 • 玻璃匀浆器 • 解剖器 • 显微镜 • 恒温水浴 • 离心机 • TU1901-紫外分光光度计 • 电炉

  5. 试剂和材料 • 1.细胞提取液 50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris） 50mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA） 0.25mol/L蔗糖 0.10mol/L氯化镁·6H2O • 2.Tris-HCl缓冲液（pH=7.4） • 3.0.25mol/L蔗糖-3mmol/L氯化钙溶液 • 4.95%乙醇 • 5.0.5mol/L三氯乙酸溶液（TCA） • 6.0.3mol/L高氯酸钙溶液（PCA） • 7.二苯胺试剂（新鲜配制） • 8.苔黑酚试剂 • 9.标准RNA溶液（40μg/mL） • 10.标准DNA溶液（0.15μg/mL） • 11.体重20g左右健康小白鼠 调pH=7.4 （新鲜配制）

  6. 3g肝脏+10mL细胞提取液 流程图 匀浆,1min 离心1000r/min,10min 核沉淀（无红细胞的核）+5mL冰冷 的0.5mol/LTCA(充分搅拌) 2000r/min5min 弃去上清 沉淀 加5mL冰冷的0.5mol/LTCA，充分搅拌2000r/min离心5min 弃去上清 沉淀 加95%乙醇5mL置60~70℃水浴5min，2000r/min离心5min（重复一次） 弃去上层脂类 沉淀 加5mL0.3mol/LPCA置90℃水浴30min搅拌，2000r/min离心5min 上清 （收集为核酸） 弃去沉淀 （蛋白质残余物）

  7. 试验流程 • 1.细胞破碎 小白鼠脱颈椎处死后，迅速剖取出肝脏，用冰冷的细胞提取液洗3次，滤纸吸干，称重，放冰冷小烧杯内，用手术剪剪成小块状，用提取液洗2次，至无色或浅粉色，再剪成浆状，转入匀浆器中，加提取液2mL,手转打匀浆约6次破碎细胞。 • 2.收集核沉淀 将匀浆液转入离心管中，离心10min（700r/min），取沉淀混悬于10mL10mol/LTris-HCl中，离心10min （700r/min），得到无红细胞的核沉淀。 • 3.核酸的分离 核沉淀中加入1mL0.25mol/L蔗糖-3mmol/L氯化钙溶液，悬液置两层纱布中过滤入离心管中，离心10min（1500r/min），收集沉淀，按上述流程图程序提取DNA和RNA。

  8. 4.RNA、DNA的定量测定 • RNA含量的测定 混匀 +样品液2mL+2mL苔黑酚试剂 用分光光度计在A640nm处测光吸收值 取2支试管 沸水浴15min +蒸馏水2mL+2mL苔黑酚试剂 查标准曲线，计算RNA含量 • DNA含量的测定 混匀 +样品液2mL+2mL二苯胺试剂 用分光光度计在A600nm处测光吸收值 取2支试管 沸水浴15min +蒸馏水2mL+2mL二苯胺试剂 查标准曲线，计算DNA含量

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