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第十四章 基因重组与基因工程

第十四章 基因重组与基因工程. 基因重组 ： genomic recombination 重组 DNA ： recombinant DNA. 第一节、自然界的基因重组. 转化： transformation 整合： integration 转导： transduction 转位： transposition. 细菌的转化. 转化. 转化 ： 由外来 DNA 引起生物类型改变的过程称为转化。. 转化. 病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。. 细胞的转化. 转染： 噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。. 整合.

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第十四章 基因重组与基因工程

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Presentation Transcript

  1. 第十四章基因重组与基因工程

  2. 基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA

  3. 第一节、自然界的基因重组 • 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition

  4. 细菌的转化 转化 • 转化： 由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。

  5. 转化 • 病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。 细胞的转化 转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。

  6. 整合 • 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步  噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。 • 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。 • 裂解：  噬菌体感染大肠杆菌的第二步  DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将细菌涨破。

  7. 整合 • 溶原和裂解可以相互转变。

  8. 转导 • 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。 • 带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。 • 来源于宿主的基因称转导基因。

  9. 转位 • 转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。 • 这些游动的基因称为转位子(transposon)。

  10. 转位

  11. 第二节、基因工程 • 基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA技术。 • 分子水平上操作，细胞水平上表达。 • 赋予重组DNA以新的生命力。

  12. 基因工程 肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。 已经证实GnT-Ⅴ与转移有关。 肝癌细胞株SMMC7721 转入GnT-Ⅴ基因 转入反义GnT-Ⅴ基因 观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为 转移 转移

  13. 基因克隆 分 切 接 转 筛

  14. 载体和目的基因 • 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。 • 常用的载体有： 质粒、  噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA • 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。

  15. 质粒 • 质粒：plasmid 环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。 • 拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。 • 质粒的性质： 易于从一个细菌转移入另一个细菌。 有两三个抗药性基因。 有一个限制性内切酶切口。

  16. 质粒 • pBR322：常用的质粒

  17. 噬菌体载体 •  噬菌体 、 M13 噬菌体 • 易于感染大肠杆菌 •  噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。 • 一个切口：插入型载体。 • 二个切口：置换型载体。

  18. 噬菌体载体

  19. 目的基因的来源 • 直接从染色体DNA中分离：原核生物 • 人工合成：简单的多肽 • 从mRNA合成cDNA：真核生物 • 基因文库：(gene library） G文库：用基因组的全部DNA制备。 c文库： 用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。

  20. 从mRNA合成cDNA

  21. 限制性内切酶的应用 • 限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构 • 回文结构：palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。 • 平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。(钝型末端) • 粘性末端：sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。

  22. 限制性内切酶的应用 • Alu I ….AGCT….. ….AG CT... 平端…..TCGA….. ….TC GA... • BamH I …GGATCC… ...G GATTC… 粘性 ...CCTAGG… …CCTAAG G… 末端

  23. 限制性内切酶的应用 切载体 限制性内切酶 相同粘性末端 切目的基因 两者相连 要点：避免切断目的基因

  24. 载体和目的基因的连接 • 人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。 • DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。 • 连接方式： 粘端连接方式尾接法

  25. 粘端连接

  26. 尾接法

  27. 重组体的转化 • 基因的转移： 重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。 • 化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法 • 物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法 • 生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体

  28. 重组体的转化 • 转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。

  29. 基因工程的表达体系的发展

  30. DNA重组体的筛选与鉴定 • 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型 • DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内切酶切割后与原来载体比较。 • 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。

  31. DNA重组体的筛选与鉴定 • 灭活法筛选重组体。

  32. DNA重组体的筛选与鉴定 提取转化细胞DNA 限制性内切酶 琼脂糖凝胶电泳 与原来载体及重组体比较

  33. 硝酸纤维素滤膜 探针 X线底片 显影 DNA重组体的筛选与鉴定 菌落 平板

  34. 基因工程策略

  35. 第三节、基因工程的应用 • 生命科学研究趋势 • 基因诊断和基因治疗 • 基因工程产品的开发和应用

  36. 生命科学研究趋势 • 基因的结构与功能研究 • 基因表达的调控 • 各种生物大分子之间的识别及结合 • 了解生命的奥秘

  37. 基因诊断和基因治疗

  38. 基因工程产品的开发和应用 • 基因工程疫苗：安全廉价 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、 • 基因工程生产激素类： 胰岛素、生长激素 • 细胞因子： 生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、干扰素

  39. 第五节、聚合酶链反应 • 聚合酶链反应：PCR polymerase chain reaction • 耐热细菌：DNA聚合酶能耐高温，在70~80℃有很高的催化力。 • 原理：以目的DNA为模板，快速合成大量的DNA，用于检测、制备、研究。

  40. 第五节、聚合酶链反应 • 变性： 95 ℃、15s • 引物粘合：55 ℃、30s • 引物延伸：72 ℃、1.5m

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