Р егуляци я транскрипции у прокариот и эукариот

1. Регуляция транскрипции у прокариот и эукариот А.В. Кульбачинский Лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов Институт молекулярной генетики РАН

2. Структура ДНК пары оснований аденин-тимин гуанин-цитозин сахаро-фосфатная цепь

3. Структура ДНК Т Каждая цепь ДНК имеет направление С А

4. ДНК-белковые взаимодействия Узнавание специфической ДНК регуляторными белками Узнавание пар нуклеотидов аминокислотами T - A helix-turn-helix C - G

5. Расположение генов в геноме Плазмида pBR322 Геном Pseudomonas aeruginosa • Гены располагаются в разных цепях ДНК • Между генами есть промежутки

6. транскрипция трансляция РНК белок ДНК репликация Структура РНК

7. нематричная ДНК 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ матричная ДНК РНК 5’ Особенности транскрипции • Начало и окончание синтеза в специальных участках • – промоторах и терминаторах • Инициация синтеза РНК без затравки • Использование рибонуклеозидтрифосфатов • Копирование одной из цепей ДНК (матричная цепь) • Направление синтеза от 5’-к 3’-концу РНК • Синтез всей молекулы РНК сразу РНК-полимераза

8. Терминация Инициация Элонгация Транскрипционный цикл Регуляторные факторы действуют на всех стадиях транскрипции

9. РНК-полимераза бактерий Холофермент 3 Кор-фермент 2 2 1 4 2 TATAAT TTGACA TATAAT -10 -35 Основные элементы промотора (-10 и -35) узнаются -субъединицей Плавление ДНК осуществляется за счет контактов  -субъединицы с нематричной цепью ДНК в районе старта транскрипции

10. Структурная модель промоторного комплекса σ2 σ4 -10 -35 σ1 Главный канал σ3 Активный центр ДНК РНКП T. aquaticus Murakami et al., 2002 • РНК-полимераза по форме напоминает клешню • ДНК связывается в главном канале • Активный центр – в глубине молекулы

11. Трехмерная структура РНК-полимеразы • Регуляторные белки • Малые молекулы • Антибиотики Nudler, 2008 РНК-полимераза – сложная молекулярная машина, состоящая из многих структурно-функциональных элементов: - взаимодействие с ДНК и РНК - синтез РНК (присоединение нуклеотидов) - связывание регуляторных факторов

12. Регуляция инициации транскрипции у прокариот Оперон - группа генов, транскрибируемых в составе одной РНК; регулируются совместно и обычно обладают общей функцией. Большинство бактерий содержат несколько -субъединиц, которые отвечают за узнавание разных типов промоторов и транскрипцию различных групп генов (регулон). Escherichia coli: 70 – гены “домашнего хозяйства” 32 – тепловой шок 38 – стрессовые условия 54 – азотный обмен

13. Репрессия оператор репрессор индуктор Регуляция инициации транскрипции у прокариот Активация активатор индуктор оператор Белок-регулятор – связывается в промоторной области и влияет на инициацию транскрипции Оператор – участок связывания регуляторного белка Индуктор – молекула (клеточный метаболит - лактоза, галактоза), контролирующая связывание активаторов и репрессоров с операторами Активаторы обычно привлекают РНКП к промотору Репрессоры – мешают связыванию РНКП с промотором

14. Примеры транскрипционных факторов Helix-Turn-Helix Номеодомен bZip Zn-finger Pazos et al., 2012

15. Регуляция инициации транскрипции у прокариот СAP – catabolite activator protein cAMP (синтезируется в отсутствие глюкозы) Взаимодействие с -субъединицей РНКП Активация катаболитных оперонов TGTGA ACACT TCACA AGTGT

16. Регуляция инициации транскрипции у прокариот • Связывание белка-активатора • Удаление белка-репрессора СAP R Активация специфического оперона R индуктор R

17. Регуляция элонгации транскрипции у прокариот Паузы и скорость транскрипции: - узнаваниеспецифических сигналов в РНК и ДНК - действие регуляторных факторов • Воздействие на активный центр РНК-полимеразы • Закрывание-открывание главного канала РНК-полимеразы

18. Регуляция элонгации транскрипции у прокариот Синтезируемая РНК способна образовывать различные вторичные структуры, что имеет важное регуляторное значение тРНК

19. Механизмы терминации транскрипции -независимая терминация -зависимая терминация Паузы, Терминация

20. Регуляция транскрипции у прокариот: аттенюация Промотор гены биосинтеза Trp Аттенюатор Рибосома РНКП Много Trp: есть Trp-tRNA, нет паузы трансляции Мало Trp: нет Trp-tRNA, пауза трансляции

21. Регуляция транскрипции у прокариот: рибопереключатели (riboswitches) Vitreschak et al., 2002 В присутствии метаболита В отсутствие метаболита образуется структура терминатора транскрипции происходит синтез полноразмерной РНК

22. Регуляция транскрипции у прокариот: рибозимы Рибозимы – молекулы РНК, обладающие каталитической активностью Консервативный элемент в 5’-концевой области гена glmS B. subtilis: В присутствии метаболита происходит активация рибозима и расщепление РНК

23. Const NNNNNN Const 5’ 3’ библиотека амплификация связывание разделение Аптамеры Искусственный отбор функциональных молекул РНК и ДНК

24. Сравнение транскрипции у прокариот и эукариот Про- Эу- -Одна РНК-полимераза (5 субъединиц) -Уровень транскрипции определяется промотором -Связь с трансляцией -Гены непрерывны -Каждая мРНК обычно кодирует несколько белков -Три РНК-полимеразы (10-14 субъединиц) -Уровень транскрипции определяется регуляторными участками (энхансеры) -Трансляция независима от транскрипции -Гены состоят из экзонови интронов, процессинг РНК -Каждая мРНК обычно кодирует один белок -ДНК организована в хроматин РНК-полимераза I –синтез рРНК РНК-полимераза II –синтез мРНК РНК-полимераза III –синтез тРНК

25. Промоторы РНКП II эукариот Три типа промоторных элементов: • Основные промоторные элементы (-45 to +40) • Связывание главных транскрипционных факторов (GTF) • Проксимальные промоторные элементы (-1kb to +200) • Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации или репрессии транскрипции (для больших групп генов) • Энхансеры/сайленсеры (десятки тыс.п.н.) • Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации /репрессии транскрипции (уникальны для данного промотора)

26. Промоторы РНКП II эукариот энхансеры (сайленсеры) проксимальные элементы основной промотор Taatjes et al., 2004 • Классы активаторов транскрипции: • Взаимодействуют с ДНК. • Передают активационный сигнал на РНК-полимеразу. • Изменяют структуру хроматина.

27. Создание синтетических регуляторных систем Ввод Выход • окраска • флуоресценция • морфология клеток • жизнеспособность клеток • химические индукторы • регуляторные РНК • свет • механические воздействия

28. Создание синтетических регуляторных систем Nandagopal and Elowitz, 2011

29. Создание синтетических регуляторных систем Системы с репрессорами / активаторами Weber et al., 2012

30. Создание синтетических регуляторных систем Изменение структуры / стабильности РНК Weber et al., 2012

31. Создание синтетических регуляторных систем Логические операции Silva-Rocha et al., 2008

32. Создание синтетических регуляторных систем Попытки создания стандартных функциональных элементов Shetty et al., 2008

33. Создание синтетических регуляторных систем Попытки создания стандартных функциональных элементов Shetty et al., 2008

34. Canton et al., 2008

35. Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы Larson et al., 2011

36. Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы • Свойства единичных молекул РНК-полимеразы различаются • Можно исследовать паузы, терминацию в реальном времени Larson et al., 2011

37. РНК-полимераза – молекулярная машина Pomerantz et al., 2005

38. Итак: 1. • РНК-полимераза – основная мишень для регуляции экспрессии генов на стадии транскрипции различными факторами: • белками, • регуляторными РНК, • малыми молекулами, • антибиотиками Использование существующих и создание новых регуляторных элементов позволяет контролировать активность РНК-полимеразы и уровень экспрессии генов в клетке и в бесклеточных системах 2. РНК-полимераза может быть использована в качестве молекулярной машины для перемещения объектов на наноуровне 3.