掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法 ; 巩固分光光度计的使用方法。

1. 实验七、硝酸还原酶活性测定 实验目的： 掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法; 巩固分光光度计的使用方法。

2. 硝酸还原酶(NR)，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。硝酸还原酶(NR)，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。

3. 高等植物硝酸还原酶的模型 • NR-含钼的黄素蛋白 • 辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD） 高等植物硝酸还原酶的模型

4. 研究趋势 【英文篇名】Determination Method of Nitrate Reductase Activity in the Leaves of Camptotheca acuminata 【作者中文名】孙世芹; 阎秀峰; 【作者单位】东北林业大学; 东北林业大学 哈尔滨; 150040; 【文献出处】东北林业大学学报, Journal of Northeast Forestry University, 编辑部邮箱2004年 03期期刊荣誉：中文核心期刊要目总览  ASPT来源刊  中国期刊方阵  CJFD收录刊 【关键词】喜树; 硝酸还原酶; 体内法; 【英文关键词】Camptotheca acuminata; Nitrate reductase; In vivo method; 【摘要】以喜树 (Camptothecaacuminata)为材料 ,探讨了用体内法测定其叶片硝酸还原酶活性的若干问题 ,比较分析了硝酸盐诱导、2 ,4 -二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对硝酸还原酶活性测定结果的影响 ,以寻求体内法测定喜树叶片硝酸还原酶活性的最佳条件。试验表明 ,体内法是一种操作简便、准确可靠的测定喜树叶片硝酸还原酶活性的方法 ,为进一步研究喜树的氮代谢奠定了基础。

5. 维普检索的中文文献 查询结果：共找到 493条,耗时0.001407秒, 当前页3/25标记数80条 • 1.卫秀英 侯小坤 张百俊 刘荷芬.氮肥对圆叶菠菜硝酸盐含量及其酶活性的影响[J].河南科技学院学报：自然科学版，2007，35(3)：35-37. • 2.刘永梅 刘永定 李敦海 沈银武.氮磷对水华束丝藻生长及生理特性的影响[J].水生生物学报，2007，31(6)：774-779. • 3.张建平 陈娟 胡一鸿 莫亿伟.镉胁迫对浮萍叶片光合功能的影响[J].农业环境科学学报，2007，26(6)：2027-2032. • 4.乔海涛 杨洪强 范伟国.缺素环境中平邑甜茶根系硝酸还原酶活性及硝态氮含量的变化[J].中国农学通报，2007，23(10)：114-117. • 5.田园 梁亮 宋波 苏小俊 袁希汉 徐海 陈劲枫.小白菜硝酸盐累积的基因型差异[J].江苏农业学报，2007，23(5)：459-463. • 6.徐永杰 金慧波.北方温室无公害蔬菜施肥技术[J].现代化农业，2007(11)：12-12. • 7.无.壳聚糖对茶树氮代谢影响[J].中国茶叶，2007，29(5)：43-43. • 8.洪华生 王玉珏 王大志.海洋浮游植物硝酸还原酶研究进展[J].海洋科学，2007，31(10)：4-10. • 9.刘萍 郭文善 浦汉春 封超年 朱新开 彭永欣.花后短暂高温对小麦籽粒蛋白质含量的影响及其生理机制[J].作物学报，2007，33(9)：1516-1522. • 10.何玲 罗佳 郭宁 杨公明.浆水芹菜发酵过程中硝酸还原酶活性和亚硝酸盐含量的变化[J].西北农林科技大学学报，2007，35(9)：184-188,194. • 11.董庆霖 赵学明 邢向英.强光照对雨生红球藻合成虾青素的影响[J].高校化学工程学报，2007，21(4)：685-688. • 12.刘亚丽 姬生栋 薛华政 张献伟 李鹏 祝红燕 陈鹏 盛有明.转大豆DNA高蛋白小麦变异株系的硝酸还原酶、叶绿素含量分析[J].河南农业科学，2007(7)：25-27. • 13.马林 孟凡德 石书兵 宋维彦 聂文魁 刘心雨 郭飞.不同耕作方式对小麦硝酸还原酶活性和旗叶衰老指标的影响[J].新疆农业大学学报，2007，30(3)：23-27. • 14.卫晓轶 李国清 王艳朋 李浩川 靳静晨 田国伟 刘宗华.不同基因型玉米某些氮代谢生理指标的差异研究[J].河南农业大学学报，2007，41(3)：264-268. • 15.曹翠玲 刘建朝 姚晨.不同呼吸抑制剂对小麦幼苗根系硝酸还原酶活性的影响[J].西北农林科技大学学报，2007，35(8)：185-188. • 16.张智猛 万书波 宁堂原 戴良香.不同花生品种氮代谢相关酶活性的研究[J].植物营养与肥料学报，2007，13(4)：707-713. • 17.张绪成 上官周平.施氮量对小麦叶片硝酸还原酶活性、一氧化氮含量和气体交换的影响[J].应用生态学报，2007，18(7)：1447-1452. • 18.毛伟华 龚亚明 夏晓剑 周艳虹 喻景权.黄瓜硝酸还原酶cDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达[J].浙江农业学报，2007，19(3)：160-163. • 19.董庆霖 邢向英 赵学明.光照强度对雨生红球藻合成虾青素的影响[J].水生生物学报，2007，31(3)：445-447.

6. 在一定条件下，NO2的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。 NO2可从组织渗透到外界溶液中，通过测定溶液中NO2含量的增加检测该酶活性。 实验原理 NO2含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下， NO2与磺胺和α－萘胺反应，生成红色化合物，在520nm下比色测定。

7. 实验器材 • 天平 • 真空泵 • 分光光度计 • 恒温箱 • 剪刀 • 试管 • 三角瓶 • 移液管

8. 主要试剂 • 0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液 • 0.2mol/L KNO3 • 磺胺试剂 • α‑萘胺试剂 • 亚硝酸钠标准液

9. 实验步骤 1. 标准曲线绘制 亚硝酸钠标准液浓度0、0.5、1.0、2.0、3.0ug/ml，即共5管溶液。 混匀上述溶液，静置20min； 520nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

10. 实验步骤 • 将实验材料用水洗净，吸水纸吸干； • 配制对照液(5ml PBS + 5mlH20)和诱导液(5ml PBS + 5ml KNO3)，置于两个烧杯中； • 用剪刀将叶片剪成边长为0.4cm的正方形小块，天平上称取0.5g重的两等份，分别投入到上述两烧杯中； • 将盛有叶片的两个烧杯进行真空抽气30min，最好使叶片沉入烧杯底部，30℃ 恒温箱中保温30min。 • 从两烧杯中分别吸取1ml反应液，注入两只试管中； • 再分别依次加入2ml磺胺试剂和2mlα‑萘胺试剂，混匀后室温静置20min; • 520nm波长下测定吸光度。 • 根据标准曲线测得NO2浓度，对照液、诱导液NO2浓度差即为NO2的生成量，可表示硝酸还原酶的活性。 2. 酶的诱导与还原反应