replikace dna n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Replikace DNA PowerPoint Presentation
Download Presentation
Replikace DNA

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 58

Replikace DNA - PowerPoint PPT Presentation


  • 188 Views
  • Uploaded on

Replikace DNA. DNA replikace (kapitola 10) Replikace chromozómu u bakterií (kapitola 10) Replikace plasmidů (částečně kapitola 25 + 20) Replikace lineárních chromozómů u Eukaryot (kapitola 10) PCR (kapitola 6). Buněčné dělení vs. reprodukce. Jednobuněčný organismus.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Replikace DNA' - urania


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
replikace dna

Replikace DNA

DNA replikace (kapitola 10)

Replikace chromozómu u bakterií (kapitola 10)

Replikace plasmidů (částečně kapitola 25 + 20)

Replikace lineárních chromozómů u Eukaryot (kapitola 10)

PCR (kapitola 6)

bun n d len vs reprodukce
Buněčné dělení vs. reprodukce

Jednobuněčný organismus

Mnohobuněčný organismus

Buněčné dělení vede k diferenciaci (zvětšení objemu jedince a jeho komplexity)

Reprodukce

asexuální

sexuální (meióza)

  • Buněčné dělení a reprodukce je simultální
      • Prokaryota (baktérie)
      • Eukaryota (Protista)
  • Horizontální přenos genů - přenos DNA bez reprodukce
  • Vertikální přenos genů - z generace na generaci
dna struktura
DNA struktura

fosfodiesterová

kostra

sense

vlákno

antisense

vlákno

báze

malý

žlábek

velký

žlábek

DNA se skládázedvouantiparalelníchřetězcůtvořícívětšinoupravotočivoušroubovici.

Bázejsouuvnitř, fosfo-diesterovákostrazvnějšku.

dna replikace
DNA replikace
  • 50. léta
dna replikace meselson stahl pokus
DNA replikace - Meselson-Stahl pokus
  • 1958
  • „ the most beautiful experiment in biology“
dna replikace1
DNA replikace
  • DNA musí být rozdělena na 2 vlákna (enzymatický komplex replisome)
  • Každé vlákno je replikováno (původní vlákno slouží jako templát)– replikace je semikonzervativní
obecn mechanismus replikace
Obecný mechanismus replikace
  • Počátek replikace (ori)
  • DNA polymeráza (DNAP)
  • Vždy ve směru 5‘  3‘
  • Leading strand vs lagging strand
obecn mechanismus replikace1
Obecný mechanismus replikace
  • DNA polymeráza potřebuje RNA primer
  • Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp)
  • Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou DNAP
  • Ligace niků
obecn mechanismus replikace2
Obecný mechanismus replikace
  • Nukleotidy jsou prekurzory pro DNA syntézu
  • dNTPs jsou vytvořeny z NTPs ribonucleotide reduktázou, kromě dUTP
obecn mechanismus replikace3
Obecný mechanismus replikace
  • Polymerizace nukleotidů
obecn mechanismus replikace4
Obecný mechanismus replikace
  • DNA polymeráza (Objevena v roce 1956 A. Kornbergem (E.coli)
    • Syntetizuje ssDNA ve směru 5‘ - 3‘
    • Může mít exonukleázovou aktivitu ve směru 3‘- 5‘
    • Potřebuje primer
    • Neumí rozplétat dvouvlákno
  • DNA polymeráza III – replikační enzym
  • DNA polymeráza I – odstraňuje primery
  • DNA polymeráza II – reparační enzym
dna polymer za iii
DNA polymeráza III
  • Několik podjednotek
    • DnaE (-podjednotka, syntéza)
    • DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita)
    • HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu)
    • DnaN (-podjednotka)
    • Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex
dna polymer za iii1
DNA polymeráza III
  • Korekturní aktivita – proofreading activity
  • 1 chybana 109 bází
synt za lagging opo uj c ho se vl kna
Syntéza lagging, opožďujícího se vlákna
  • Okazakiho fragmenty
  • Priming complex – primosom
    • PriA vyváže SSB
    • Naváže se primáza (DnaG)
    • Syntetizuje krátký RNA fragment
synt za lagging opo uj c ho se vl kna1
Syntéza lagging, opožďujícího se vlákna
  • Ukončení syntézy
    • Série fragmentů, které nejsou spojeny
    • 3-krokové spojení daných fragmentů: Ribonukleáza H, DNA polymeráza I a DNA ligáza
topologick probl my p i replikaci dna
Topologické problémy při replikaci DNA
  • Rozpletení dvoušrobovice (800b/s) pomocí helikázy
    • Oba řetezce je nutno oddělit a prootočit (-100 na 1000b)
    • Chromozom nemůže jen tak rotovat
    • Vzniklé napětí je uvolněno topoisomerázami (DNA gyrázou)
      • DNA gyráza zavádí negativní superspiralizace a tím uvolňuje pozitivní superspiralizaci způsobenou helikázou
komplex replika n vidli ky
Komplex replikační vidličky
  • Proteiny, které se účastní replikace
    • DNA gyráza
    • Helikáza
    • Single-strand binding protein
    • DNA polymerase
replikace kruhov molekuly
Replikace kruhové molekuly
  • Baktérie
  • 2 replikační vidličky (-replikace)
  • DNA replikace a buněčné dělení je synchronizováno
  • iniciace replikace v ori (oriC)
    • Iniciační komplex obsahuje 5 proteinů: DnaA, DnaB, DnaC, DNA gyrázu, SSB
    • oriC obsahuje repetice 3x GATCTNTTNTTTTa 4x TTATNCANA
    • Vazba DnaA proteinu
    • Na rozvolněnou DNA se naváže DnaB a DnaC – začátek replikační vidličky
    • Helikáza aktivuje primázu a tím pádem syntézu primeru
replikace kruhov molekuly1
Replikace kruhové molekuly
  • Ukončení replikace – Ter místa
  • Replikace probíha v obou směrech (po směru a proti směru hodinových ručiček)
    • TerC, TerB, TerF
    • TerA, TerD, Ter E
    • Vážou Tus proteiny
    • Jejich delece jsou slučitelné se životem, replikační vidlička je nepotřebuje k ukončení replikace
    • Separace spojených molekul toposiomerázou IV
bun n d len a replikace
Buněčné dělení a replikace
  • Generační čas E. coli od 20-ti minut po několik hodin
  • Replikace chromozómu vždy 40minut
  • Kompletace buněčného dělení 20 minut
replikon
Replikon
  • Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo linearní)
    • Genomy virů, viroids
    • Chromozómy - kruhové
    • Chromozómy - lineární (konce musí být chráněné před exonukleázovou aktivitou – smyčky, nebo proteiny)
    • Genomy mitochondrií a chloroplastů
    • Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární)
    • Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek)
    • Mitochondrie
    • Plastidy (primární a sekundární)
plasmidy
Plasmidy
  • Kruhové molekuly DNA samostatně se množící
    • Vyjímka jsou lineární plasmidy a RNA plasmidy (zjednodušené RNA viry)
  • Parazitují na buněčném aparátu pro svou replikaci
  • Přinášejí buňce určitou selekční výhodu
  • Nemohou být bez buňky
  • Vyskytují se v různém počtu (obvykle 1-2 plasmidy/chromozóm, ale až 50)
  • Velikost plasmidu je velmi různá
  • Plasmidy mohou nést gen zajišťující resistenci na antibiotikum
  • Kryptické plasmidy (bez očividné funkce)
  • F-plasmidy – specificke pro E.coli a baktérie rodu Shigella a Salmonela
  • P-plasmidy – promiskuitní
  • Transferability vs mobility
  • Některé plasmidy mohou být lineární (z Borrelia a Streptomyces)
line rn plasmidy vyj mka
Lineární plasmidy - vyjímka
  • Nalezeny u některých baktériích a hub
  • Nemají telomery
  • Vlásenková struktura chrání konce DNA u Borrelia (plasmid je velmi důležitý pro virulenci borélií)
  • dsDNA vazebné proteiny chrání konce DNA u Streptomyces
replikace plasmidu
Replikace plasmidu
  • Obousměrná replikace
  • Replikace valivou kružnicí
replikace valivou kru nic je tak pou v na viry
Replikace valivou kružnicí je také používána viry
  • Stejný mechanismus replikace ukazuje na příbuzný vztah mezi plasmidy a viry
mechanismus replikace plasmidu f konjugace
Mechanismus replikace plasmidu F - konjugace
  • Nejstarší známý plasmid (byl náhodou přítomne v izolátu E.coli K12, Stanford, 1928)
  • Nízké copy number, 100kb
  • Konjugativní vlastnosti
    • Tra+ transfer positive plasmidy
    • tra geny (nejméně 30 genů)
    • F+ (donor) and F- (recipient)
    • Bakteriální sex
mechanismus replikace plasmidu f conjugation
Mechanismus replikace plasmidu F - conjugation
  • Replikace valivou kružnicí
  • ssDNA se pohybuje skrz konjugační most do druhé buňky
  • Některé malé plasmidy jsou tra-, ale mob+ (mohou být mobilizovány za přítomnosti Tra+ plasmidu)
p enos chromozom ln dna d ky f plasmidu
Přenos chromozomální DNA díky F-plasmidu
  • Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion sequence)
  • baktérie, které mají F plasmid v chromozómu - Hfr strains
  • Celý chromozóm může být přenesen za 90 minut
  • F plasmid se umí vyštípnout z chromozómu, nese část chromozómu – F‘ plasmid
p enos chromozom ln dna d ky f plasmidu1
Přenos chromozomální DNA díky F-plasmidu
  • Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion sequence)
k ontrola po tu plasmid v bu ce pomoc anti sense rna
Kontrola počtu plasmidů v buňce pomocí anti-sense RNA
  • High copy plasmid regulují svůj počet pomocí limitace startu replikace
  • Low copy plasmid – striktní regulace, replikují se s replikací buňky
  • Regulace studovaná pro plasmid ColE1
  • Iniciace replikace ColE1
    • Syntéze pre-primeru (555bp) – RNA_II
    • Je štípnut ribonukleázou H (volný 3‘-OH)
      • Tento enzyme je specifický pro DNA:RNA
    • DNA polymeráza pokračuje
    • NEBO
    • Syntéza RNA_I – 108bp, váže se na RNA_II
    • Ribunukleáze nemůže štípnout RNA_II
    • DNA polymeráza nemá volný 3‘-OH konecx
    • Replikace nemůže začít
z vislost bu ky na plasmidu
Závislost buňky na plasmidu
  • Buňka přežije pouze v případě, že si udrží plasmid
    • 2 komponenty produkované plasmidem: toxin (více stabilní) and protijed (méně stabilní)
    • Protein-based operon F-plasmidu: CcdA (protijed) a Ccd B (toxin, inhibuje DNA gyrázu)
    • RNA-based systém: protijed je antisense RNA, která neumožňuje translaci toxinu (Hos-killing protein – Hok and Sok antisense RNA)
  • Benefiční plasmidy
    • Resistence na antibiotika
    • Resistence na těžké kovy
    • Resistence vůči UV atd. (Table 20.01)
plasmidy s resistenc na antibiotika
Plasmidy s resistencínaantibiotika
  • R plasmidy
  • Objeveny během 2.svět. války v Japonsku
  • Bacteria Shigella resistentní vůči sulfonamidům
  • R plasmidy jsou transferu schopné
  • Resistentní kmeny baktérií jsou velmi problematické
  • Zákaz používaní lidských antibiotik na prevenci nákazy u zvířat
  • Použití v genovém inženýrství
resistance v i laktam antibiotik m
Resistance vůči -laktam antibiotikům
  • Nejrozšířenější skupina antibiotik (penicilín, ampicilín, cephalosporin)
  • Působí na buněčnou stěnu baktérií
  • Obsahují -laktam kruh
  • Resistence díky enzymu -laktamázy (bla gen)
  • Modifikace antibiotické struktury – více odolná na štěpení enzymem
  • Administrace antibiotika + lactam analogu (clavulanic kyselina), který se váže na enzym
resistence to chloramphenicol
Resistence to chloramphenicol
  • Chloramphenicol, streptomycin a kanamycin
  • Působí na bakteriální translaci (vážou se na 23S rRNA)
  • Resistence:
    • Chromozomální mutace ribosomálních proteinů – nedojde k inhibici pomocí antibiotika, ale sníží se efikace translace
    • Plasmidová – chloramphenicol acetyl transferáza (CAT)
re z istence na aminoglykosidy
Rezistence na aminoglykosidy
  • Streptomycin, kanamycin, neomycin
  • Obvykle 3 cukerné kruhy, z nichž alespoň jeden nese aminokyselinu
  • Vážou se na SSU ribozómu a inhibují translaci
  • Inaktivace jejich aktivit pomocí modifikací (fosforylace, acetylace, adenylace)
  • Resistence: neomycin phosphotransferase (npt gen)
  • Derivát kanamycinu U – Amikacin – jeho acetylace schopný cukerný zbytek je blokován hydroxybutyratovou skupinu – i přes to již došlo k evoluci nové N-Acetyl transferázy, která je schopna acetylovat tuto molekulu
resistence v i tetracyklinu
Resistence vůči tetracyklinu
  • Tetracyklin se váže na 16S rRNA a inhibuje translaci
  • Inhibuje prokaryotickou i eukaryotickou translaci (eukaryota ho aktivně neimportují, spíše naopak, efektivně ho exportují)
  • Resistence:
    • Plasmid R kódující transporter, který umožnuje efektivní export tetracycklinu zpět do prostředí
ti plasmids
Ti plasmids
  • Tumor-inducing (Ti)
  • Přenos mezi baktérií a rostlinou
  • Ti plasmid se nachází v baktérii Agrobacterium
  • Část plasmidu je přenesena do rostlinné buňky pomocí procesu připomínající konjugaci
  • Dojde k začlenění (náhodnému) do chromozómu a k expresi růstových hormonů – nádor a místo pro množení baktérie
ti plasmid
Ti plasmid
  • T oblast plasmidu obsahuje geny pro auxin (zvětšuje objem buňky), cytokin (indukuje replikaci buňky) a opin (zdroj energie pro bakéterii)
    • Ti plasmid může vstoupit také du kvasinkové a savčí buňky (v laboratoři)
  • Použití v genovém inženýrství
    • Arabidopsis thalianna – 27 000 genů přerušeno pomocí Ti plasmidu – inaktivace genu – studium fenotypu
2 plasmid kvasinek
2 plasmid kvasinek
  • Kruhová molekula 6318bp (dsDNA)
  • 50-100 kopií/haploidní genom
  • Nachází se v jádře!, váže histony a formuje nukleozóm
  • Použítí v genovém inženýrství – eukaryotický klonovací vektor
  • Skladba:
    • 2 obrácené repetice (rozdělují plasmid na 2774 a 2346bp)
    • Flp rekombináza (flippase) katalyzuje rekombinace, rozeznáva Frt místo
    • Může dojít k inzercím, či delecím daných segmentů pokud jsou ohraničeny Frt místy
    • Flp/Frt systém je podobný Cre/loxP systému
replikace line rn ch chromoz m telomery
Replikace lineárních chromozómů - telomery
  • Problém při replikace lineárních chromozómů
    • DNA polymeráza potřebuje primer
    • Po odstranění RNA primeru dojde ke zkrácení DNA
    • Buněčné hodiny
    • Telomery
      • OPAKOVANÉ KRÁTKÉ SEKVENCE (20-STOVKY), OBVYKLE 6 BÁZÍ
      • TTAGGG – OBRATLOVCI
      • TELOMERASE – PRODLOUŽÍ KONCE DNA O JEDEN TANDEM
      • PROTEKCE PROTI EXONUKLEAZOVÉ AKTIVITĚ
      • EXTRÉMNĚ KONZERVOVANÉ
replikace line rn ch chromoz m
Replikace lineárních chromozómů
  • Protein primery
    • DNA polymeráza může použít volnou –OH skupinu z proteinu
    • Systém používán některými viry a bakterií rodu Streptomyces (lineární chromozóm)
replikace line rn ch chromoz m1
Replikace lineárních chromozómů
  • Mnoho počátků replikace (10 000 až 100 000 u dělící se somatické buňky)
  • Obousměrná
  • Replikační bublina
  • Synchronizace
    • každý chromozóm je replikován pouze jednou
    • každý počátek prochází iniciací pouze jednou
po tek replikace
Počátek replikace
  • Nejlépe studován u kvasinek
  • ORC komplex (origin recognition complex) se váže na na počátek replikace a spouští řadu reakcí:
    • Cdc6, Cdt1 a ORC a MCM (helicase) = pre-replicative complex (pre-RC)
    • Tento komplex se formuje pouze v G1 fázi
    • Pre-RC je aktivován kinázou S-CDK a aktivuje Sld2 a Sld3
    • Sld2 a Sld3 se váže na Dpb11 a ten přináší cdc45a DNAP 
    • Pre-loading complex, pre-LC
synt za eukaroytick dna
Syntéza eukaroytické DNA
  • Stejný princip jak u baktérií
  • Komplikovanější
  • MCM – minichromosome maintenance
  • DNAP  , , 
    • DNAP  - primase – iniciace replikace, syntetizuje primer, který pak prodlužuje pomocí dNTPs – 20nt – iDNA
    • RPA A – replication protein A – chrání ss
    • RFC – replication factor C – váže se na iDNA, přibírá do komplexu posuvnou svorku (PCNA protein) + 2 DNAP
    • DNAP  - přepisuje opožďující se vlákno
    • DNAP  - přepisuje vedoucí vlákno
    • PCNA protein je trimer
    • Regulatory proteiny – Cdc45, GINS complex – neznámá funkce
    • Primery jsou odstraněny pomocí exonukleázy Fen1 a/nebo Dna2 (rozdíl oproti baktériím)
    • Mezery jsou dosyntetizovány DNAP  a spojeny pomocí DNA ligázy
slide48
PCR
  • Polymerázova řetezcová reakce
    • Umožňuje namnožení DNA z velmi malého množství
slide49
PCR
  • Polymerázova řetezcová reakce
    • Komponenty PCR reakce jsou:
      • PCR primery
      • DNA polymerase (from Thermus aquaticus)
      • dNTPs
      • PCR instrument
slide50
PCR
  • Polymerázová řetězová reakce
    • Cyklus:
      • 90°C – denaturace
      • 50°C – 60°C – nasedání primerů
      • 72°C – elongace
      • 90°C – denaturace

30x

slide51
PCR
  • Polymerázová řetězová reakce
    • 2. cyklus
slide52
PCR
  • Polymerázová řetězová reakce
    • 3. cyklus
slide53
PCR
  • PCR primers
    • Primer design
    • Degenerativní primery
    • Přidání restrikčních míst
inverzn pcr
Inverzní PCR
  • Sekvenování neznáme sekvence kolem známé
  • Štípnutí DNA restrikčním enzymem (nesmí štípat ve známé sekvenci)
  • Vytvoření kruhovité molekuly
  • PCR
  • Sekvence
rt pcr
RT PCR
  • Složitá manipulace s geny obsahující exony
  • mRNA již obsahuje sekvenci, která je translatovatelná
  • Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z retrovirů) vytvoření DNA z mRNA
  • Vytvoření jednoho vlákna cDNA – templátová DNA
  • Studium exprese genů
race rapid amplification of cdna ends
RACE – rapid amplification of cDNA ends
  • Celou délku cDNA jednoho genu je občas složité získat
  • Nedostatečné množství cDNA pro další experimenty
  • Na 5‘ konci bývají sekundární struktury
  • RACE generuje kompletní konce 5‘ a 3‘ ve dvou produktech
  • Na rozdíl od RT PCR, primer obsahuje ukotvující sekvenci
directed mutagenesis
Directed mutagenesis
  • Umožňuje změnu sekvence
  • Substitute, delece či inzerce aminokyselin
  • Původní plasmidová DNA izolovaná z baktérií je methylována
  • Nová pomocí PCR vytvořená plasmidová DNA není methylována
  • Restrikce za použití enzymu, který štípe pouze methylovanou sekvenci
  • Transformace pouze nově vytvořeného plasmidu
pojmy kter jsou d le it k zapamatov n
Pojmy, které jsou důležité k zapamatování
  • Horizontální a vertikální přenos genů
  • Replikace
  • Vedoucí a opožďující se vlákno
  • Replikační vidlička
  • Replisom
  • Semi-konzervativní replikace
  • Obousměrná replikace
  • DNA gyráza
  • Topoisomeráza IV
  • DNA polymeráza vs. RNA polymeráza
  • RNA primer vs iDNA
  • SSB proteiny
  • NTP vs dNTP
  •  replikace
  • Primáza
  • Syntéza dNPTs a enzymy účastnící se
  • DNA polymeráza I, II, III
  • DNA polymeráza ,,
  • Proofreading, mismatch
  • Okazakiho fragmenty
  • DNA ligáza
  • Počátek replikace
  • Ter místa, terminus
  • Telomera, telomeráza
  • Eukaryotická replikace vs. Prokaryoticá
  • MCM, PCNA protein, pre-RC a pre-LC komplexy
  • Plasmid
  • Copy number
  • Replikace valivou kružnicí
  • Mobilita vs transferabilita
  • Antibiotika a resistence
  • CoEl plasmid
  • R plasmid
  • Ti plasmid
  • 2 plasmid
  • Flipáza a frt místo
  • PCR
  • RT PCR
  • RACE
  • Inverzní PCR
  • mutageneze