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[ 目的要求 ]. 鸡血细胞的融合实验. 1. 掌握细胞融合的概念及基本原理。 2. 初步掌握 PEG 诱导细胞融合技术。 3. 了解细胞融合技术的生物学和医学意义。. [ 实验原理 ]. PEG 是乙二醇的多聚化合物,存在一系列不同分子 量的多聚体。 PEG 可与水分子借氢键结合 , 在高浓度 (50 % ) 的 PEG 溶液中自由水消失,导致细胞脱水而发 生质膜结构的变化,引起细胞融合。为了发挥 PEG 促 进细胞融合的效力,必须采用较高浓度的 PEG 溶液, 但在高浓度 PEG 溶液下,细胞可能因脱水而受到显著 的破坏。因此,选择合适的分子量、浓度及作用时间

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Presentation Transcript
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[目的要求]

鸡血细胞的融合实验

1.掌握细胞融合的概念及基本原理。

2.初步掌握PEG诱导细胞融合技术。

3.了解细胞融合技术的生物学和医学意义。

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[实验原理]
  • PEG是乙二醇的多聚化合物,存在一系列不同分子

量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合,在高浓度

(50%)的PEG溶液中自由水消失,导致细胞脱水而发

生质膜结构的变化,引起细胞融合。为了发挥PEG促

进细胞融合的效力,必须采用较高浓度的PEG溶液,

但在高浓度PEG溶液下,细胞可能因脱水而受到显著

的破坏。因此,选择合适的分子量、浓度及作用时间

是PEG融合技术的关键。

本实验材料为鸡红细胞,其核结构紧密,易于观察。

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[实验用品]
  • 1. 器具:普通光学显微镜、普通离心机、恒温水浴箱、10 ml刻度离心管、试管架、吸管、注射器、载玻片等。
  • 2. 材料:新鲜鸡血或与Alsever液混合的备用鸡血。
  • 3. 试剂:50%PEG(现用现配),Alsever液,0.85%生理盐水,GKN液,Janus green染液或Giemsa染液。
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[实验步骤]

1.鸡血的采集与抗凝

将新鲜鸡血与Alsever液按1∶4混成悬液

(抗凝效果最佳),或存放 4℃冰箱保存备用

(3~4天内可用)。

2. 50%PEG溶液的配制

称取适量PEG (Mr 4000) 放入烧杯中,将其加热熔化,待冷却至50℃,加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀,37℃保温备用。PEG溶液需使用前现配。

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(1)离心洗涤:

取(1:4)鸡血悬液lml加0.85%生理盐水至5m1,混匀。

3000rpm,1min,弃上清

(重复2次)

加GKN溶液至5ml,混匀。

3000rpm,1min,弃上清。

3.细胞融合操作

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(2)水浴

加GKN溶液至0.5m1,混匀。

39℃水浴5min

缓慢逐滴加0.25ml的50%PEG至悬液,边加边混匀。

水浴15min

加入GKN溶液至5m1,混匀。

水浴10min

3000rpm,1min,弃上清

加入GKN溶液至5m1,混匀,3000rpm,1min。

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(3)结果观察:

弃去上清液,加入GKN溶液至0.5ml处,混匀。取

1~2滴悬液滴于载玻片上,加入Janus green染液2~3滴,用牙签搅匀,8min后盖上盖玻片,观察细胞融合情况。

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[实验结果及分析]

  • 在显微镜下观察细胞融合情况,可看到不同融合
  • 状态的细胞:两细胞的细胞膜间相互接触、粘
  • 连;接触部位的细胞膜崩解,两细胞间的细胞质
  • 相通,形成细胞质通道;通道扩大,两个细胞连
  • 成一体;细胞合并完成,形成一个含有两个或多
  • 个核的圆形细胞。
  • 2. 计算融合率:
  • 融合率=视野内发生融合的细胞核总数/视野内所有细胞核总数×100%
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[注意事项]

1.滴加50%PEG时,应缓慢、逐滴加入,而且每

加一滴应轻摇离心管以混匀,滴加完毕后可用

滴管温和混匀。

2.高Ca2+浓度能提高细胞的融合率。

3.因PEG对细胞有毒性,应严格控制作用时间于

1~2min,但本实验中融合后的细胞不继续培

养,可将处理时间延长至15min以达到最高融

合率。

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[作业]

绘制显示所观察到的细胞融合情况图。

  • [思考题]

1.细胞融合率受哪些因素的影响?

2.在进行细胞融合时,要注意那些问题?