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定序上常見之 trouble shooting~

定序上常見之 trouble shooting~. PART I. Sample preparation:. Too much template DNA Too little DNA template Chemical contaminant DNA contamination. Too much template DNA. Signal intensity: G( 13694 ), A( 13557 ), T( 12394 ), C( 11252 ). 原因 : 在 PCR 過程中 ,template 濃度過高所造成

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定序上常見之 trouble shooting~

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Presentation Transcript

  1. 定序上常見之trouble shooting~ PART I

  2. Sample preparation: • Too much template DNA • Too little DNA template • Chemical contaminant • DNA contamination

  3. Too much template DNA Signal intensity: G(13694), A(13557), T(12394), C(11252) 原因:在PCR過程中,template 濃度過高所造成 特徵:分析軟體顯示一般 G intensity皆大於 (10000)以上 Eletrophorgram 之圖示會有很強之background 影響到major band之判讀 解決方式:直接將上機之樣品重新以 HiDi formamide 稀釋後再重跑即可

  4. Too little DNA template Ave signal intensity:G(101),A(69),T(76),C(71) 原因:在PCR過程中,template 濃度過低所造成 特徵:分析軟體顯示一般 G intensity皆小於 (300)以下 Eletrophorgram 之圖示會發現序列讀到600bps後因 DNA 不足導致 background會拉高且序列讀不長 解決方式:重新再一次 PCR,增加反應中 DNA 的 template

  5. Chemical contaminant 處理前 Signalintensity: G(427), A(302), T(216), C(247) 處理後 原因:在 PCR 過程中,因樣品本身製備過程不當或是遭到污染 例如:鹽類,蛋白質,清潔劑或是其他抑制劑污染，進而影響到PCR的過程 特徵: Eletrophorgram 之圖示會有很強之background 影響到 major band 之判讀 且序列通常都讀不長 解決方式:直接將樣品重新純化後再重新做定序反應

  6. DNA contamination 原因:在點菌過程中挑菌污染,挑到two clone 特徵:Eletrophorgram 之圖示會發現一般前60-70bps序列是非常sharp 但是之後的序列會有很強的兩個peak 重疊且訊號也不低 解決方式:重新挑菌抽 plasmid 定序

  7. 定序上常見之trouble shooting~ PART II

  8. 定序報告常見之Eletrophogram~ • No signal • Signal noise • Excess dye peaks • Secondary structure • N-1, N-2, N-3... Priming Sequencing Trace

  9. No signal Signalintensity: G(32), A(37), T(40), C(34) 原因:(1) PCR反應失誤 (2) Clone失敗 (3) primer 錯誤 特徵:Eletrophorgram 之圖示無訊號 (No signal) 解決方式(1)重新做定序反應排除人為失誤因素 (2)建議重新clone

  10. Signal noise Signal intensity: G(44), A(46), T(49), C(48) 原因:(1)PCR反應過程中DNA濃度不足 (2)PCR反應人為操作失誤 (3)primer合成效率不佳 = (PCR過程中primer Tm 過低) = (primer 品質變差) (4)DNA 品質不佳(degraded) 特徵:Eletrophorgram 之圖示會發現訊號微弱 且雜亂,定序讀不長 signal intensity lower，導致 free big dye 殘留 解決方式: (1)重新反應調整DNA濃度並排除人為 操作失誤 (2)check primer quality and Tm值 調整PCR annealing Tm (3)Run Gel check DNA quality 重新純化或製備樣品

  11. Noise data through sequence, with good signal strength 原因:multiple primer binding area 特徵(1)Eletrophorgram 之圖示會發現有兩個訊號幾乎等高之peak (2)sinal intensity high (3)序列一開始即很雜亂，two peak overlapping 解決方式:更換 primer

  12. 範例(1): 第一次定序結果 Primer: T7 第二次定序結果 Primer: M13F T7(+): 5-`TTA TAC GAC TCA CTA TAG G-3` T7(-)=5`-att atg ctg agt gat atc c-3`

  13. 範例(2): 第一次定序結果 Primer: T7 第二次定序結果Primer: M13F =發現有兩個T7 binding 位點

  14. Excess dye peaks 原因:(1)PCR 反應中 DNA 濃度過低 (2)酒精沉澱不完全，有ddNTP螢光殘留 特徵:Eletrophorgram 之圖示在 70-80bp 及 110-120bp 有很強 signal ,影響 major peak 的判讀 解決方式:(1)重新PCR,調整DNA濃度 (2)酒精沉澱步驟確實

  15. Secondary structure 原因:DNA self-ligation 或是形成 hair pin /loop structure 特徵:Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從二級結構位點開始訊號突然低下且雜亂 解決方式:調整反應試劑或是反應之條件

  16. Secondary Structure範例(1) 使用一般PCR條件之定序結果 調整PCR條件之定序結果 更改之條件如下~ Denature temperature: 98 Denature time : 3 min Buffer : DMSO Dye : B5 Ta ：55

  17. Secondary structure 範例(2)~ 原因:連續 GCA rich 導致PCR過程中Polymerase shift, 因而影響後面序列之判讀 特徵: Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從 GA rich 後開始訊號突然變低且雜亂 解決方式:調整使用可解除二級結構之反應試劑或是反應之條件

  18. Secondary structure 範例 (3)~ 原因:連續 poly A or T 有可能形成 hair pin structure導致 PCR 過程中 primer binding mismatch 因而影響後面序列之判讀 特徵:Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從poly A/T 後開始訊號突然低下且雜亂 解決方式: (1)建議更換另一端primer (2)調整使用可解除二級結構之試劑或是反應之條件

  19. N-1, N-2, N-3... Priming Sequencing Trace 原因: primer品質不佳,有N-1情形 特徵:Eletrophorgram 之圖示會發現 major band peak 下會有 miner peak 而且 miner peak可與後一個base相對應。 解決方式:重新合成primer

  20. 其他~ • Noise up to or after a specific point in the sequence Point mutation (SNP=single nucleotide polymorphism) inserction

  21. Clogged capillary array所造成 Capillary has bubble 所造成 原因:毛細管中有雜質或氣泡影響 DNA migration 特徵: Eletrophorgram 之圖示會不隨機出現，再不特定的位置產生雜訊干擾結果 解決方式: 重新更換位置重跑一次

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