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善假于物也

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  1. 1.2 基因工程的基本操作程序 善假于物也

  2. 补:原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 与RNA聚酶结合位点 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点,并与其结合。 转录开始后,RNA聚合酶沿DNA分子移动,并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后,RNA链释放出来,紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。

  3. 原核细胞的 基因结构 编码区 :能转录相应的信使RNA,能 编码蛋白质 ①不能转录为信使RNA,不能 编码蛋白质。 非编码区 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列,在该序列中, 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。

  4. 非编码区 非编码区 补:真核细胞的基因结构 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 与RNA聚酶 结合位点 外显子 内含子 外显子: 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子: 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子能转录为信使RNA

  5. 真核细胞的 基因结构 外显子:能编码蛋白质的序列 内含子:不能编码蛋白质的序列 编码区 非编码区 :有调控作用的核苷酸序列, 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。 非编码序列: 包括非编码区和内含子

  6. 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 不连续 连续 编码区 非编码 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质,原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗? 不一样.真核细胞基因结构要长一些.

  7. 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定

  8. 一、目的基因的获取 1、目的基因的来源 ①从自然界已有的物种分离 ②人工方法合成 2、目的基因主要是指______________________ 编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 目前被广泛提取使用的有:苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。 3、获取目的基因的方法 (1)从基因文库中获取 (2)利用PCR技术扩增 (3)人工合成

  9. (1)从基因文库中获取目的基因 什么是基因文库? 什么是部分基因文库? 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因? 目的基因的有关信息与什么相联系?

  10. 基因组文库 部分基因文库(如cDNA文库) 概念:基因文库 (gene library) 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

  11. 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.

  12. 思考:基因文库如何构建? 1)基因组文库的构建 基因组DNA 限制酶 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段,再与合适的载体在体外重组后,导入受体菌的群体中储存,这个群体就称为该生物基因组文库。此种构建基因文库的方法称直接分离法(或鸟枪法)。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 基因重组 体外包装 转化细菌

  13. mRNA 2)cDNA文库的构建 反转录酶 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。此种构建基因文库的方法称反转录法。 cDNA 基因重组

  14. 基因组DNA文库与cDNA文库构建的比较 cDNA文库 基因组DNA文库

  15. 基因组文库与部分基因文库的关系 DUCK179制作

  16. 思考:如何从基因文库中得到所需要的基因? 依据:目的基因的有关信息。 如:根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。

  17. 1、构建基因组DNA文库时,首先应分离细胞的 A、染色体DNA   B、线粒体DNA C、总mRNA   D、tRNA A 2、目的基因可从基因文库中获得,下列有关基因文库的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段,导入某个生物 体内,则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库 C

  18. (二)利用PCR技术扩增

  19. (2)利用PCR技术扩增 聚合酶链式反应 ① 概念:PCR全称为_______________,是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 体外 特定DNA片段 DNA复制 ②原理:__________ 已知基因的核苷酸序列 ③条件:_______________________、 _______________、___________ (做启动子)、 ___________. 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 ④方式:以_____方式扩增,即____(n为扩增循 环的次数) 2n ⑤结果: 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增

  20. ⑥过程: a、DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板 在热作用下,_____断裂,形成___________ 氢键 单链DNA b、退火(复性55℃-60℃):系统温度降低,引 物与DNA模板结合,形成局部________。 双链 c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,从 引物的5′端→ 3′ 端延伸,合成与模板互补的________。 DNA链

  21. 3/ 5/ G—G T—C A—G 3/ 5/ 引物Ⅰ 3/ 5/ C—C G—A 复性 G—G 5/ 3/ 引物Ⅱ 延伸 PCR原理 变性

  22. PCR(多聚酶链式反应)

  23. 1、在遗传工程中,若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG/TACAC,要使其数量增多,可用PCR技术进行人工复制,复制时应给予的条件是 ①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温 A.①③④⑦⑧⑨ B.①②④⑥⑦⑧ C.①②⑤⑥⑦⑨ D.①③⑤⑥⑦⑧ D 2、在基因工程中,把选出的目的基因(共1000个脱氧核苷酸对,其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个)放入DNA扩增仪中扩增4代,那么,在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个 B

  24. 肽链氨基酸序列 推测 信使RNA序列 推测 基因的核苷酸序列 合成 目的基因 较小 (3)人工合成:若基因_____,核苷酸序列又 ______ ,则可用此法。 已知 化学合成法

  25. 1、在已知序列信息的情况下,获取目的基因的最方便方法是1、在已知序列信息的情况下,获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法    B、基因组文库法 C、cDNA文库法   D、聚合酶链反应 A 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A.①②③④ B.①②③ C.②③④ D.②③ D

  26. 2、基因表达载体的构建 ——核心 ①用一定的_________切割 质粒,使其出现一个切 口,露出____________。 ②用_____________切断目 的基因,使其产生_____ ____________。 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同 的黏性末端 切口 ③将切下的目的基因片段插入质粒的______处, 再加入适量___________,形成了一个重组 DNA分子(重组质粒) DNA连接酶

  27. 质粒 DNA分子 同一种 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子(重组质粒) 2、基因表达载体的构建 ——核心

  28. 经此过程,基因表达载体的构建就成功了? 思考:作为基因工程表达载体,只需含有目的基因就可以完成任务吗?为什么?

  29. 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用,还需要有其他控制元件,如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是:不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用,还需要有其他控制元件,如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是: (1) 生物之间进行基因交流,只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达; (2) 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序列导入受体生物中无法转录; (3) 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记; (4) 为了增强目的基因的表达水平,往往还要增加一些其他调控元件,如增强子等; (5) 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位,往往要加上可以标识存在部位的基因(或做成目的基因与标识基因的融合基因),如绿色荧光蛋白基因等。

  30. 基因表达载体的组成: a、目的基因 位于基因的首端,是mRNA结合位点 b、启动子 位于基因的末端,终止转录 c、终止子 检测目的基因是否导入受体细胞 d、标记基因 它们有什么作用?

  31. ABCD 1、(多选)一个基因表达载体的构建应包括 A.目的基因 B.启动子 C.终止子 D.标记基因 A 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位,是起始密码 B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段,对mRNA的转录起调控作用 C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别

  32. 3、将目的基因导入受体细胞 受体细胞 转化 —— 目的基因进入_________内,并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 稳定 表达 农杆菌转化法 将目的基因导入 植物细胞 基因枪法 花粉管通道法 方法 将目的基因导入 动物细胞 ——显微注射法 将目的基因导入 微生物细胞 ——Ca2+处理法

  33. 3、将目的基因导入受体细胞 • 常用的受体细胞: 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理: 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径

  34. 1、将目的基因导入植物细胞 表达 插入 转入 导入 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力 特点: Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 (1)农杆菌转化法 转化过程: 表达载体 植物细胞 农杆菌 新性状 Ti质粒 目的基因 植物细胞染色DNA 构建

  35. (2)基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法,是利用压缩气体产生的动力,将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。

  36. (3)花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后,花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后,花粉形成的花粉管还未愈合前,剪去柱头,然后,滴加DNA(含目的基因),使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

  37. 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射法 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 显微注射 移植到子宫 取受精卵 受精卵发育 新性状动物

  38. 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法:Ca2+处理 常用菌:大肠杆菌 微生物作受体细胞原因: 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程: 感受态细胞吸收DNA 表达载体与感受态细胞混合 Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞

  39. 导入过程完成后,全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗?导入过程完成后,全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗? 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 • 所以要对受体细胞作怎样的处理? 对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测 • 怎样进行检测? 通过目的基因上的标记基因,进行筛选和检测

  40. 1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞,原因是 A.结构简单、操作方便 B.繁殖速度快 C.遗传物质含量少、简单 D.性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A.①②③④ B.①②③ C.②③④ D.①②④ B D 3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达 C

  41. 8. 采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的做法正确的是 ①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组,注射到棉的子房并进入受精卵中 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组,导人细菌感染棉的体细胞,再进行组织培养 A.①② B.②③ C.③④ D.①④ C

  42. 4、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 检测— ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 Go on

  43. 知识延伸——DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则,把互补的双链DNA解开,把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记,之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交,从而检出所要查明的DNA或基因。

  44. a DNA 变性 DNA杂交 (如检测SARS病毒等) b 附着在膜上 c 硝化纤维素 报告基因(含荧光素分子) 加探针 d 返 回

  45. 归纳: 基因工程的基本操作程序 • 获取目的基因 • 从基因文库 • 利用PCR • 化学方法人工合成 • 构建基因表达载体 • 目的基因、启动子、终止子、标记基因 • 将目的基因导入受体细胞 • 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理法 • 目的基因的检测与鉴定 • 检测:是否插入、转录、翻译 • 鉴定:

  46. 求异思维 你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗? 反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样,反转录酶也以5′→3′方向合成DNA。 cDNA合成过程是:第一步,反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链,形成RNA-DNA杂交分子。第二步,核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解,使之变成单链的DNA。第三步,以单链DNA为模板,在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链,形成双链DNA分子。

  47. 寻根问底 1.为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗? 构建基因文库是获取目的基因的方法之一,并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知,就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中,直接获得,也可以通过反转录,用PCR方式从mRNA中获得,不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知,或只知道目的基因序列的一段,或想从一种生物体内获得许多基因,或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同,或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同,或者想得到一种生物的全基因组序列,往往就需要构建基因文库。

  48. 2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗?如果这么做,结果会怎样? 有人采用总DNA注射法进行遗传转化,即将一个生物中的总DNA提取出来,通过注射或花粉管通道法导入受体植物,没有进行表达载体的构建,这种方法针对性差,完全靠运气,也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多,严格来讲不算基因工程。

  49. 思考与探究: 1.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株,因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物; ②要加趋化和诱导的物质,一般为乙酰丁香酮等,目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢(趋化性)和激活农杆菌的Vir区(诱导)的基因,使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。