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干细胞研究进展

干细胞研究进展. 南京凯基生物科技发展公司 联系电话： 025-52880811 025-52880812. 干细胞的基本概念 胚胎干细胞系的建立过程 胚胎干细胞研究的进展情况 胚胎干细胞的研究意义 胚胎干细胞研究的困难及解决办法. 人体发生过程： 受精 卵裂 受精后 72h 受精后 5-7 天

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干细胞研究进展

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Presentation Transcript

  1. 干细胞研究进展 南京凯基生物科技发展公司 联系电话：025-52880811 025-52880812

  2. 干细胞的基本概念 • 胚胎干细胞系的建立过程 • 胚胎干细胞研究的进展情况 • 胚胎干细胞的研究意义 • 胚胎干细胞研究的困难及解决办法

  3. 人体发生过程： 受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天 精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构 囊胚 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群 中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统

  4. 干细胞的基本概念 1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。 2、分类： （1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞） 　　　　　　 生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞） 　　 具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 （2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发 育成完整个体的能力。 （3）单能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。

  5. 横向分化： 部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。

  6. 胚胎干细胞的性质 • 衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； • 永生化(immortal)； • 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； • 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； • 能参与胎儿所有组织的发育过程；

  7. 胚胎干细胞系的建立过程

  8. 干细胞来源： (1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞 (2) 从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（embryonic germinate cells） (3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞 （embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT） 　　去核卵细胞 + 体细胞核 克隆 囊胚 分离内细胞群ES细胞

  9. 胚胎干细胞的分离 酶消化后培养 免疫方法去处滋养层细胞 1、免疫亲和柱分离法2、免疫磁珠分离法 流式细胞仪分离法

  10. 培养条件： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF)，抑制细胞分化。

  11. 培养细胞的传代生长过程 细胞传代经历四个阶段： • 滞后期 • 对数生长期 • 稳定期 • 衰退期

  12. 滞后期 • 包括悬浮期和潜伏期。细胞的胞质收缩，包体呈圆球状，悬浮于培养基中。经过一段时间的培养，有活力的细胞开始附着于底物并逐渐延伸，恢复原来的形态，但还不分裂增殖。正常细胞的滞后期约为24～96小时。

  13. 对数生长期 • 细胞增殖旺盛，开始阶段细胞的增长速率与最初细胞数成正比，此时细胞数量呈指数增长。此期持续时间的长短因细胞本身的特性和培养条件而异，一般持续3～5天。

  14. 稳定期 • 此期细胞虽仍保持分裂增殖能力，但增殖的细胞数与死亡的细胞数相当，从而处于一种动态平衡的状态。

  15. 衰退期 • 处于稳定期的细胞如不传代或不加入新的培养基，则会进入衰退期，逐渐死亡。此期死亡细胞数超过分裂细胞数，细胞数因此逐渐减少。

  16. 培养细胞的细胞周期 • G1期发生在上一细胞周期的M期之后，此细胞周期S期之前，有称为细胞分裂后期。在G1期主要发生与DNA合成前有关的生化变化。 • S期此期主要进行DNA的合成，各种细胞的S期持续时间的差别较小，一般为6～8小时。

  17. 培养细胞的细胞周期 • G2期发生在DNA合成后或细胞分裂前，有称细胞分裂前期。G2期持续时间较短，一般为2～3小时。 • M期即细胞分裂期。处于分裂期的细胞是评价细胞增殖和生长能力的参考指标。此期持续时间很短，一般只有1～2小时

  18. 5. 注意事项 • 污染预防和处理 • 培养基成分 • 培养基的酸碱度 • 接种细胞应处于对数生长状态。处于静止期的细胞在新鲜培养基中开始阶段生长缓慢或根本不生长。

  19. 干细胞特性

  20. 干细胞诱导分化的常用方法 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细 胞内

  21. 胚胎干细胞的鉴别 干细胞具有以下特点： (1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2)端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植 　 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞

  22. 鉴定干细胞的常用方法： （1） 细胞形态与结构 （2）细胞功能 （3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达

  23. 造血干细胞的鉴定： （1）细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小 （2）细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1);L/TAL-1； CD34；GATA-1； （3）基因表达：TAL-1；GATA-2；βH1；β主要珠蛋白

  24. 内皮细胞 : （1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡 （2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素αvβ3；CD34；JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及MEC-14，7抗原 （3）特异基因表达：flk-1；flt-1；tie-2

  25. 心肌干细胞： （1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If （3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链

  26. 神经干细胞 : （1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突 （2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体 （3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，β微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志） （4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和GluR-6，递质合成酶TH和GAD67，GAD65，GFAP和NF-L的表达

  27. 胰岛细胞: 细胞标志：GATA-4（胚胎和胚外内胚层的标志），HNF3β（胚胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽IAPP；葡萄糖转运蛋白-2（Glut-2） ； 胰岛β细胞的特征及特定标记物：胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）；转录因子IPF1/PDX1和NgN3（Neurogenin3）

  28. 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。

  29. 1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。

  30. 避免免疫排斥的方法 （1）Knock-out 胚胎干细胞的组织相 容性抗原 （2）Knock-in 受者的组织相容性抗原 （3）与同一来源的造血干细胞一同移植 （4）受者的体细胞核移植

  31. ES细胞研究的趋势 • 改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得ES细胞的方法。 • 定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。 • 成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？

  32. Thank You !

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