BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 4

1. CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 4 http://users.unimi.it/mpl/lezioni.html

2. STUDIO DELLA FUNZIONE GENICA

3. ARRAY MACROARRAY MICROARRAY

4. DNA microarray (o gene/genome chip, DNA chip, o gene array) è una collezione di depositi puntiformi di DNA, ciascun punto rapresentante un singolo gene immobilizzati su un supporto (vetro, plastica o silicone) mediante legami di tipo irreversibile. Esempio di microarray con 40.000 oligo immobilizzati su supporto solido e ibridati con cDNA

5. APPLICAZIONI DI ARRAY: • SNP detection arrays – per identificareSingle nucleotide polymorphismnelgenomadi diverse popolazioni • comparative genomic hybridization (Array CGH) – per identificareriarragiamenticoinvolgenti un numerosignifictativodibasi • mRNA or gene expression profiling – per studiare I livellidiespressionedimigliaiadigenisimultaneamente • Chromatin immunoprecipitation (chIP) studies – per determinareillegamedispecifcheproteine in porzionispecifiche del DNA (ChIP-on-chip technology)

6. Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP) polimorfismo a singolo nucleotide • di base Nel genoma umano ci sono 200.000 SNP all’interno di sequenze codificanti, alcuni di questi possono essere marcatori di patologia http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/snps.html

7. Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP) Gli SNP sono la causadi circa il 90% dellavariabilitàgeneticaumanaed in generesitrovauno SNP ogni 100-300 pb. 2/3 SNP vedonosostituita la C con T. Individuo 1 Individuo 2 Perchè una variazione possa essere considerata un SNP deve essere presente in almeno l’1% della popolazione

8. Metodi di identificazione di SNP

9. IBRIDAZIONE ALLELE-SPECIFICA

10. REAZIONE DI ELONGAZIONE DI PRIMER FISSATO SU SUPPORTO SOLIDO

11. TA GC 3’ 5’ AT CG TAGC TG AC 3’ 5’ DNA is denatured and mixed with oligonudeotides and ligase. The ligase joins pairs of oligonudeotides annealed head to tail if they are correctly base-paired at the junction. Radioactively labeled oligonudeotides (*) are immobilized and detected by autoradiography only if ligated to biotinylated oligonucleotides (B) that can be bound to streptavidin on a solid support. LANDEGREN, et al. Science 1998

12. Michiel J. T. van Eijk*, et al. NAR 2004

13. BANCHE DATI E IDENTIFICAZIONE DI SNP dbSNP sono presenti (“annotati”) in diverse banche dati quali: PubMed, genome project sequences, GenBank records, the Entrez Gene database, and the dbSTS database of sequence tagged sites.

14. mRNA or gene expression profiling

17. Genes x Cells Drugs x Cells ClusteredImageMaps Genes x Drugs

18. DatabaseMicroarrayExperiment SetsSample Profiles • Genomics and bioinformaticsgroup NCI and NIH

19. Studio diproteinecheinteragiscono con DNA

20. ChIP-on-chip (o ChIP-chip) è una tecnica che combina la immunoprecipitazione di cromatina (chromatin immunoprecipitation"ChIP” con la tecnologia del micro array(microarray technology “chip").

22. read-out Normalizzazione dei dati e analisi esplorativa dei dati Sito DNA “estrazione delle informazioni” arricchimento proteina di interesse

23. Le prime analisi si sono focalizzate sulle differenze tra animali in Proestro e Metestro, per vedere se la differenza dei livelli di Estradiolo circolante avesse degli effetti sull’espressione genica. Come atteso, gli animali LID non mostrano nessuna significativa differenza nell’espressione genica nelle due fasi del ciclo, come se quest’ultimo fosse appiattito. Gli animali WT, al contrario, mostrano deboli ma rilevabili differenze nelle due fasi; tuttavia, il quadro osservato e’ totalmente inatteso, in quanto i geni differenzialmente espressi sono tutti geni MAGGIORMENTE espressi nella fase di metestro o, guardando all’inverso, downregolati nella fase di Proestro. Considerando cio’ che abbiamo sempre osservato, vale a dire un’attivazione del recettore degli estrogeni in fase di proestro, questo stupisce. Upregulated in M WT M vs WT P WT P vs WT M SEM Analysis Downregulated in P

24. GO Term Analysis • Una volta identificati i trascritti differenzialmente espressi nei due gruppi (t test & SAM analysis, tenendo in considerazione solo quelli con Fold Indution >=1,5), si cerca di capire se questi geni sono implicati in determinati ‘Biological Process’ o hanno particolari ‘Molecular Function’ o interferiscono in un determinato ‘Pathway’. • Questa analisi si puo’ fare a diversi “livelli”, i risultati riportati si riferiscono ad un livello piuttosto superficiale, ma per questo piu’ generale e credo indicativo. • Riporto: • BP = Biological Process • MF = Molecular Function • Pathway • L’analisi e’ stata fatta principalmente con DAVID • http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp • piu’ molti altri software e websites (le risorse sono infinite)

25. Biological Process - WTall vs LIDall Considerando tutti i trascritti differentemente espressi, sia upregolati che downregolati. I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_BP_WTall_vs_LIDAll.xls’

26. Molecular Function - WTall vs LIDall I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_MF_WTAll_vs_LIDAll.xls’

27. Gene Ontology http://www.geneontology.org/index.shtml Un progetto atto a costruire un vocabolario per descrivere geni e prodotti genici attribuibili a ogni organismo Questo vocabolario serve per dare un unico nome a un specifico prodotto in modo che questi così compaia nelle diverse banche dati e possa venire rapidamente ritrovato • Ogni gene/proteinasicontraddistingue per un numeroidentificativounico (GO:nnnnnnn) e un nome (es: cellula, fibroblasto, fattoredicrescita, trasduttore del segnale). Ogniterminevieneassegnato a unadelletresuddivisionidellabanca (ontology): • Funzionimolecolari • Componenticellulari • Componenti I processibiologici

28. The three organizing principles of GO are cellular component, biological process and molecular function. A gene product might be associated with or located in one or more cellular components; it is active in one or more biological processes, during which it performs one or more molecular functions. For example, the gene product cytochrome c can be described by the molecular function term oxidoreductase activity, the biological process terms oxidative phosphorylation and induction of cell death, and the cellular component terms mitochondrial matrix and mitochondrial inner membrane.

29. Topology The ontologies are structured as directed acyclic graphs, which are similar to hierarchies but differ in that a more specialized term (child) can be related to more than one less specialized term (parent). For example, the biological process term hexose biosynthetic process has two parents, hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process. This is because biosynthetic process is a type of metabolic process and a hexose is a type of monosaccharide. When any gene involved in hexose biosynthetic process is annotated to this term, it is automatically annotated to both hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process.

30. I LIMITI DELLA ANALISI GENOMICA: RIPRODUCIBILITA’ ANALISI NON QUANTITATIVA I mRNA NON RIFLETTONO ESATTAMENTE LE PROTEINE PRESENTI NELLA CELLULA

31. proteomica Il fine dellaproteomicaconsistenellacompletaidentificazionedelleproteine e dellaloroespressione in determinati cellule o tessuti La metodologiasu cui sibasa la proteomicacomprende: gel elettroforesibidimensionale; HPLC e spettrometriadimassa

32. (20,000 to 25,000 genes vs. > 500,000 proteins). • E’ statocalcolatocheilcorpoumanopuo’ esprimerefino a 2 milionidiproteine, ciascuna con differentifunzioni

33. I metodi della proteomica • dagli anni ‘70: gel elettroforesi bidimensionale Limiti di definizione e riproducibilità • Anni ’90 spettrometria di massa • con metodi di ionizzazione alternativi (electrospray o MALDI Matrix Assisted Laser DesorptionIonization) Non si amplificano le proteine: dimensione campioni Identificazione dei peptidi da miscele complesse Rapidità Analisi quantitativa Limiti nelle conoscenze di genomi da diversi organismi Disponibilità di strumentazione

34. electrospray ionization liquid chromatography mass spectrometry

35. John Bennett Fenn ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2002 per lo sviluppo della tecnica di elettrospray per l’analisi di macromolecole biologiche

36. Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) per analisiproteomicaquantitativa

38. Functional and quantitative proteomics using SILAC SILAC (Stable isotope labelling with amino acids in cell culture) Mann Nature Reviews Molecular Cell Biology7, 952–958 (December 2006) | doi:10.1038/nrm2067

39. Proteomica e trascrittomica a confronto Uno studio in cui si sono comparati i dati di analisi di cellule MCF-7 Su un totale di 7278 geni identificati in modo univoco come messaggi o proteine 55% provengono da analisi proteomica 77% provengono da microarray

40. LE PROSPETTIVE DELLA PROTEOMICA: • continuo progresso della tecnologia per misure sempre più su larga scala e rapide • costruzione di banche dati • protomica interviene in cellule dove mRNA non è informativo (es cellule ematiche) • La misura proteomica fornisce l’end point, il microarray va verificato con qPCR e da western • La proteomica permette di studiare la presenza di modificazioni post-traduzionali, di interazioni proteina-proteina

43. INTERATTOMICA analisi del trascrittoma, del proteoma e dell’interattomacomparati per arrivare a definire le funzionifisiologichediciascun gene

44. L’INTERATTOMA O BIOLOGIA DEI SISTEMI (system biology)

45. L’interattomarappresentainterazionimolecolari con un sistemadigrafico Per grafico intendiamo un insieme di punti, nodi o vertici che sono tra loro collegati non in modo unidirezionale. Nel digrafico la direzionalità o bidirezionalità dell’evento è segnata

47. ‘OMICS APPLICAZIONI MEDICHE Test genetici Terapia genica Farmacogenomica Informazioni sulla malattia