实验三 芳香族化合物的定性、定量分析 — 高效液相色谱法

1. 实验三 芳香族化合物的定性、定量分析—高效液相色谱法

2. 1 实验目的 • 了解并掌握高效液相色谱法的分离原理 • 学习并掌握高效液相色谱仪的操作 • 掌握保留时间初步定性和外标法的定量方法 • 学习使用Empower Pro中文版色谱工作站处理数据

3. 2 实验原理和仪器结构 2.1 高效液相色谱法分离原理 高效液相分配色谱法有反相或正相色谱法两种分离模式。反相高效液相色谱法是指采用非极性固定相（如C18等）、极性溶剂（如甲醇等）作为流动相的一种分离模式。正相色谱法与反相色谱法相反，它是以极性固定相（如带有氨基和氰基的固定相），非极性溶剂（正己烷等）为流动相的一种液相色谱分离模式。极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的固定相上的相互作用较弱，分配较少，因此随着流动相较快流出，反之，疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用，在柱内保留的时间相对较长。

4. HPLC分离的机理

5. 色谱柱分离示意图 本实验采用反相色谱分离模式

6. 2.2 仪器流程

8. 进样 淋洗液 废液 样品 至分离柱 六通阀的工作原理 装样 （ＬＯＡＤ） （ＩＮＪＥＣＴ） 进样阀 淋洗液 废液 样品 至分离柱 样品环

9. 3 实验仪器设备、试剂、溶液和实验用品 3.1 仪器 高效液相色谱仪：美国WATERS 600高压泵，WATERS 2996型二极管阵列检测器和Rheodyne 7725i六通阀进样器；Empower Pro中文版色谱工作站；BS210S型电子分析天平；100 µL微量进样器。 3.2 试剂与样品 甲醇（99.9 %）：色谱纯；水：二级水；苯（99.5 %）、甲苯（99.5 %）、二甲苯（99.0 %）均为分析纯；试样。

10. 3.3 溶液 苯、甲苯和二甲苯混合标准工作溶液（约30 g/mL）；试样溶液。 3.4 实验用品 每小组按4人计，容量瓶：100 mL 1只（共用）；具塞刻度试管：10 mL 5支；移液管：0.1 mL 3支（共用）、1 mL 1支（共用）。

11. 4 高效液相色谱仪的操作条件 • 流动相：甲醇水=7525； • 流动相流速：0.8 mL/min；氦气鼓泡脱气； • 色谱柱：Waters C8 (150 mm4.6 mm5 µm)不锈钢柱； • 定量管：20 L； • 柱温：25 ℃； • 检测波长范围：195 nm ~ 400 nm； • 提取波长：254 nm； • 采样速率：1.0； • 分辨率：1.2 nm； • 仪器控制：自动曝光； • 3D数据采集； • 保留时间：苯：约3.0 min；甲苯：约3.8 min；二甲苯：约4.7 min。

12. 5 实验步骤 5.1 标准工作溶液和试样溶液的配制 先取少许流动相置于100 mL容量瓶中，放入天平中去皮归零，用移液管分别量取0.1 mL苯、甲苯、二甲苯于容量瓶中并依次称重，精确至0.0001 g，然后用流动相定容制备成标准溶液母液。取标准溶液母液0.3 mL用流动相稀释定容至10 mL即配制成约30 g/mL的苯、甲苯、二甲苯标准混合工作溶液。 试样溶液由实验课教师配制编码并分发给各实验小组。

13. 5.2 开机测定样品 5.2.1 使用HPLC级流动相，必要时自行制备；水为二次蒸馏水。用前均需过0.22 µm滤膜。 5.2.2 流动相脱气：打开氦气（99.999 %）高压钢瓶，调节减压阀输出压力0.5 MPa。确认流动相管线和相对应的脱气管线。开始洗脱前，以100 mL/min的速率脱气至少15 min，然后以20 ~ 50 mL/min速率维持脱气，直至分析工作完成。 5.2.3 开机：顺序接通WATERS 2996、600。打开计算机电源，进入WINDOWS XP，启动Empower Pro中文版色谱工作站。

14. 5.2.4 排除泵室气泡：当正常工作流速时显示无压力或压力波动时，此时一般要排气。方法是打开排液阀，设置流速10 mL/min，待排出气泡后恢复原有设置。 5.2.5 双击配置系统，建立分析项目。双击运行样品，创建方法组。根据实际分析的样品和要求，设置WATERS 600泵和检测器的工作参数。顺序点击设置、进样按钮，准备开始分析。

15. 5.2.6 进样：将六通阀手柄置于LOAD状态。用微量进样器装样，注入5倍于定量管体积的试样溶液；装样后将手柄顺时针置于INJECT状态开始进样，同时会听到蜂鸣声及屏幕提示，这时工作站开始记录。待进样后2 ~ 3 min，将手柄转回LOAD位置，这时才能取下进样器，装样准备开始下次分析。注意必须使用液相色谱仪专用进样器，避免损坏阀片，造成漏液。在规定的高效液相色谱分析条件下，待基线平稳后，连续注入数针标准混和工作溶液，直至相邻两针的峰面积变化小于1.5 %时，按照进样规则的顺序（标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液）进样分析。本实验先对苯、甲苯、二甲苯单标溶液逐一进样分析，确定苯、甲苯、二甲苯的各自相对保留时间。接下来用苯、甲苯、二甲苯标准混和工作溶液进样建标后，获得相应的色谱图和典型光谱图，并在相同分析条件下对试样溶液进行测定，确证组分，计算结果。

16. 1 2 3 A / AU t / min 1 苯；2 甲苯；3 二甲苯 苯、甲苯、二甲苯混标工作溶液高效液相色谱分离图

17. A / AU λ/nm t / min 苯、甲苯、二甲苯混标工作溶液的3 D图

18. A / AU λ/nm 苯的紫外吸收光谱图

19. 5.2.7 关机：测试完毕，先用100 %水冲洗至压力平衡，持续10 min，改为90 %甲醇水溶液洗脱至柱压平衡，持续5 min。将流速设置为0 mL/min后顺序关闭WATERS 600、2996电源开关。关闭氦气钢瓶气阀。处理数据打印报告后，关闭计算机和总电源开关。

20. 6 实验数据处理 6.1 试样溶液中组分的定性 根据标准样品溶液中组分的各自相对保留时间，对试样溶液中的组分进行对比定性确认。 6.2 试样溶液中组分含量的计算 6.2.1 外标法手动计算试样中各组分的浓度含量 定量分析就是要测定样品中某一组分的准确含量。常用色谱的定量方法有内标法和外标法。本实验采用定量管外标法。

21. 外标法又可分为标准曲线法或单点或双点校正曲线法。本实验采用单点校正曲线法。将测得的两针试样溶液以及其前后两针标准混合工作溶液，相应组分的峰面积，分别进行平均。外标法又可分为标准曲线法或单点或双点校正曲线法。本实验采用单点校正曲线法。将测得的两针试样溶液以及其前后两针标准混合工作溶液，相应组分的峰面积，分别进行平均。 以浓度表示的各组分含量X（g/mL），按下式（3）计算： ……………………………（3） 式中： C1 — 标样溶液中，相应组分的浓度（g/mL）； A1 — 标样溶液中，相应组分峰面积的平均值； A2 — 试样溶液中，相应组分峰面积的平均值。

22. 6.2.2 用Empower Pro中文版色谱工作站自动计算试样中各组分的含量 选择标准工作溶液文件，双击进入主窗口，提取色谱图。点击处理方法指南→新建处理方法→处理类型：PDA→下一步→下一步→用鼠标拖放选择积分范围→下一步→最小面积：10000→下一步→下一步→输入色谱峰名称→下一步→输入标样中各组分的名称、含量及单位→下一步→外标校正→下一步→下一步→下一步→下一步→输入方法名称→完成。 返回主窗口界面。点击方法组，选择采集分析数据时用的仪器方法，点击文件保存到方法组，关闭。在项目窗口点击修改样品快捷键，将样品类型由未知改为标准样，点击量快捷键，输入量值和单位。点击从方法组复制快捷键，打开，确定，存盘退出。点击项目窗口中更新，原来未知变为标准样。此时，标准样品建立完毕。将标准样品和试样文件选上，右键查看，从文件中打开方法组，按结果快捷键，即可显示标准样品结果。按浏览中下一个3D通道，可显示出试样的计算结果。

23. 7 注意事项 7.1 首先打开检测器，避免其他组件的干扰，避免检测器的自检不通过。 7.2 用微量进器吸取样品溶液时，不要将气泡注入色谱系统中，以免引起系统压力不稳。 7.3 分析样品前，首先吸取一定量的溶剂，注入色谱仪，记录溶剂色谱峰。 7.4 及时添加流动相，工作状态时切不可使液面低于泵头。

24. 8 对实验报告的要求及说明 8.1 实验报告内容应包括实验目的、原理和实验结果。 8.2 对实验结果和实验过程的综合分析。 8.3 对本实验设计的评价和建议。 8.4 每小组共用计算机打印出的苯、甲苯、二甲苯标准混和工作溶液和试样溶液的色谱图和数据。

25. 9 思考题 9.1 从仪器构造、分离原理和应用范围三方面比较HPLC和GC的异同点。 9.2 为获得对混和物较好的分离度，总结高效液相色谱法可以调整的分析条件。 9.3 试分析苯的保留时间为什么比甲苯的短？