莫能菌素生物合成中 转录调控因子的分析

1. 莫能菌素生物合成中 转录调控因子的分析 姓 名：逄爱萍 指导教师：赵广荣 日 期：2013年4月10号

2. 1.研究背景 肉桂地链霉菌莫能菌素生物合成基因簇

3. 调控 转录因子 抗生素 通过分析抗生素转录因子的调控作用，进而 对菌株进行改造，可以提高抗生素的产量。

4. 2.研究内容 1、目标基因的克隆：从S. cinnamonensis克隆monRI、monRII 、monH基因。 2、表达载体的构建：选择合适的载体，将上述基因与启动子、终止子等连接，构建高效表达载体。 3、蛋白的优化表达与纯化：将载体转化到大肠杆菌中，优化表达条件，纯化可溶性蛋白。 4、转录因子与核酸的杂交：通过EMSA实验，确定与转录因子结合的启动子。

5. 提取基因组 PCR获得 目的片段 构建表达载体 提取质粒 纯化质粒 测序验证 技术路线 EMSA实验 优化表达并 纯化可溶性蛋白 电转到宿主菌

6. monRII 的PCR产物电泳（左） pET28a-monRII 酶切电泳（右） 1、表达载体pET28a-monRII构建过程

7. 1、BPES362/pET28a-monRII 1：37℃，1.0 mmol/L，包涵体； 2：37℃，1.0 mmol/L，上清；3：37℃，0.8 mmol/L，包涵体； 4：37℃，0.8 mmol/L，上清；5：30℃，1.0 mmol/L，包涵体； 6：30℃，1.0 mmol/L，上清； 7：30℃，0.8 mmol/L，包涵体；8：30℃，0.8 mmol/L，上清；M：protein marker

8. 用Ni-NTA树脂纯化BPES362 1：孵育后； 2：第一次洗涤； 3：第二次洗涤； 4：第三次洗涤； 5：第四次洗涤； 6：第五次洗涤； 7：第一次洗脱； 8：第二次洗脱；M：protein marker BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化（37℃，IPTG=1.0mmol/L）

9. 用Ni-NTA树脂纯化BPES362 目的蛋白 1：第九次洗脱； 2：第八次洗脱； 3：第七次洗脱； 4：第六次洗脱； 5：protein rulerII； 6：第五次洗脱； 7：第四次洗脱； 8：第三次洗脱 BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化（37℃，IPTG=1.0mmol/L）

10. 莫能霉素启动子的标记实验 从图中可以看出，启动子浓度在15.5fmol/ul时，标记后依然清晰可见。因此，选定启动子浓度为15.5fmol/ul做EMSA。

11. EMSA实验

12. 启动子T 启动子E 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 结合 未结合

13. 启动子AI 启动子AIX 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

14. 启动子AVII 启动子D 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

15. 启动子AX 启动子RII 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

16. 结论：只有启动子E和T与转录因子monRII结合。

17. monRI 的PCR产物电泳（左） pET28a-monRI 酶切电泳（右） 2、表达载体pET28a-monRI构建过程

18. 3、BPES361/pET28a-monRI（37℃） 1：1.0 mmol/L，包涵体； 2：1.0 mmol/L，上清；3：0.8 mmol/L，包涵体； 4：0.8 mmol/L，上清；5：0.6 mmol/L，包涵体； 6：0.6 mmol/L，上清； 7：0.4 mmol/L，包涵体；8：0.4 mmol/L，上清；9：空白对照；M：protein marker

19. BPES361/pET28a-monRI (30℃) 1：0.1 mmol/L，包涵体； 2：0.1 mmol/L，上清；3：0.3 mmol/L，包涵体； 4：0.3 mmol/L，上清；5：0.5 mmol/L，包涵体； 6：0.5 mmol/L，上清； 7：0.8 mmol/L，包涵体；8：0.8 mmol/L，上清；9：空白对照； M：protein marker

20. BPES361/pET28a-monRI (20℃) 1：0.3 mmol/L，包涵体； 2：0.3 mmol/L，上清；3：0.1 mmol/L，包涵体；4：0.1 mmol/L， 上清；5：0.05mmol/L，包涵体； 6：0.05mmol/L，上清；7：空白对照； M：protein marker

21. BPES361/pET28a-monRI 的最佳表达条件为：20℃，IPTG终浓度0.5mM。 但以此条件进行蛋白的纯化，没有得到满意的效果

22. monH基因直接PCR没有成功，于是分两段PCR。由于monH基因中间有PstI酶切位点，可以从这里分段。monH基因直接PCR没有成功，于是分两段PCR。由于monH基因中间有PstI酶切位点，可以从这里分段。 3、表达载体pET28a-monH构建过程

23. monH1 的PCR产物电泳（左） pET28a-monHI 酶切电泳（右） monH2的PCR产物电泳（左） pET28a-monH酶切电泳（EcoRI、HindIII）（右）

24. BPES363/pET28a-monH 37℃诱导表达 1：0.1 mmol/L上清； 2：0.1 mmol/L，包涵体；3：0.3mmol/L，上清；4：0.3 mmol/L，包涵体；5：0.6mmol/L，上清； 6：0.6mmol/L，包涵体；7： 0.9mmol/L，上清 8： 0.9mmol/L，包涵体；M：marker

25. monH7C 的PCR产物电泳（左） pGEX4T2-monH7C 酶切电泳（右） 4、表达载体pGEX4T2-monH7C构建过程

26. BPES364/pGEX4T2-monH7C(37℃） 1：空白对照；2：0.002 mmol/L，上清； 3：0.002 mmol/L，包涵体； 4：0.02 mmol/L，上清；5：0.02mmol/L，包涵体；6：0.1mmol/L，上清； 7：0.1 mmol/L，包涵体；8：0.4 mmol/L，上清 9：0.4 mmol/L，包涵体；

27. 用GST树脂纯化BPES364 目的蛋白 1：离心后；2：孵育后； 3：第一次洗涤； 4：第二次洗涤； 5：第三次洗涤； 6：第四次洗涤；7：第五次洗涤； 9：第一次洗脱； 10：第二次洗脱；M：protein marker BPES364/pGEX4T2-monH7C蛋白纯化（ 37℃，IPTG 0.4mM)

28. 用GST树脂纯化BPES364 目的蛋白 1：第三次洗脱； 2：第四次洗脱； 3：第五次洗脱； 4：第六次洗脱； 5：第七次洗脱； 6：第八次洗脱；7:第九次洗脱M：protein rulerII； BPES364/pGEX4T2-monH7C蛋白纯化（ 37℃，IPTG 0.4mM)

29. 3、结论 1、转录调控因子monRII的EMSA实验已经完成，下一步需要确定具体结合位点。 2、调控基因monH关键区域的表达载体已经构建好，并纯化出可溶性蛋白，下一步需要进行EMSA实验。 3、调控基因monRI的表达载体已经构建好，下一步需要优化并纯化出可溶性蛋白。

30. THANK YOU !