一教学要求

一教学要求 实验八酶联免疫吸附试验（ELISA） • 掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理 • 学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操作

二实验原理 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。 ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。

（1）直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。

（2）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量＝抗体量。

（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。

（4）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

三材料与器材（略）

四操作步骤 （1）抗体包被：羊抗人IgG 酶联板每孔加100 µL，4 ℃ 过夜；甩净。（2）封闭：2% 小牛血清，每孔加100 µL，37 ℃ 封闭30 min；封闭后洗三次（前两次用自来水冲、甩；第三次用洗液，并静置 3 min，甩）（3）加待测抗原：正常人血清稀释成,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80 ,生理盐水作为对照，每孔加 100 µL，注意从高稀释度到低稀释度加样，37 ℃ 孵育1h ；洗三次（4）加酶标抗体：HRP-IgG（PBS-Tween，5%BS；1：800稀释），每孔加 100 µL，37 ℃，30 min；洗三次

（5）酶催化反应：底物显色剂（0.2 mol/L Na2HPO4 加1:1的0.1M柠檬酸，3% H2O2加1.5µL/mL，TMB（DMSO溶，10 mg/mL）每孔加50 µL，37 ℃ 闭光反应15 min；（6）加2mol/L H2SO4 50 µL 终止反应，观察颜色反应，并用酶标仪测量OD。

五注意事项 （1）正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持 3 min再弃去。（2）加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。（3）底物应在临用前配制，同时注意避光。

六思考题 （1）分析酶标抗体不纯对抗原检测结果的影响（双抗夹心法）（2）比较免疫荧光法和ELISA的最适检测对象。

一 教学要求