免疫组织化学技术

1. 免疫组织化学技术 IHCT—Immunohistochemistry technique 定义：在组织细胞原位，通过抗原/抗体反应 和组织化学的呈色反应，借助可见的标 志物，对被检测抗原/抗体进行定性、 定位和定量检测的免疫学测定技术。 特点：结免疫学反应特异性和组织化学可见 性为一体；借助先为显微镜放大，于细 胞或亚细胞水平测定抗原/抗体。

2. 免疫组织化学技术 • 类型：酶免疫组化技术 荧光免疫组化技术 免疫电镜技术 亲和免疫组化技术 （标记物等的不同） 实例：

3. 自制E－二抗(1:100) 商品E－二抗(1:200) 阳性患者 阴性患者

4. 图20 伊文氏蓝复染效果图 A.阳性标本检测效果 B.阴性标本检测效果 C.阳性标本复染后的效果 D.阴性标本复染后的效果 A B D C

5. 一、免疫组化技术介绍 • （一）标本制作 • （二）抗体的选择 • （三）抗原/抗体反应 • （四）改善标本的通透性 • （五）对照项的设立 • （六）检测结果的判断

6. （一）标本制作 • 标本— 指固定在玻片上用作为抗原的，如 组织、细胞或微生物。

7. 标本的类型—组织切片、印片、涂片。 • 1.印片法： • 优点：操作简单，抗原保存好缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背 景染色。

8. 2.组织切片 • 组织切片---冷冻切片/石蜡切片介绍： • 特点：组织新鲜、速冻，恒温冷冻切片机 片厚5～10μm，-20℃保存；后者只 要求固定的标本，经脱水+浸蜡包埋 常温切片机，片厚2～3μm～ 优点： 前者抗原丢失少，结构保证完好； 后者片薄观察结构清晰，宜连续性可 作回顾性研究。 缺点： 前者细胞清晰度差，现用难保留；后 者抗原量少，易出现非特异着色，需 前处理。

9. 1).切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶。1).切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶。

10. (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。

11. 切片要求及注意事项：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)52－60℃烤片18h。(3)切片厚2～4μm。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）切片要求及注意事项：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)52－60℃烤片18h。(3)切片厚2～4μm。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）

12. 标本的固定 • 标本固定需达到目的：细胞内蛋白凝固 • 终止胞内酶活性 • 保持细胞固有态 • 除干扰性类脂等 • 理想固定剂：能快速固定细胞抗原 • 防止抗原物质扩散 • 固定后抗原的特性不改变 • 例：10%中性福尔马林液、丙酮、乙醇

13. 标本的保存（温度、时间） 1.冷冻保存：2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80℃冻存。3.蜡块的保存4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。

14. 标本的预处理（目的、注意点） • 为什么要进行酶消化和抗原修复？ • 醛键形成 • 羧甲基形成 • 甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。

15. 抗原修复(Antigen Retrieval;AR) • 1 酶消化 (1)原理：1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白2)断交联 (2)蛋白酶的种类

16. 胰蛋白酶 0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。 • 胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀释，消化时间37℃ 30～180min。 • 蛋白酶K 20μg/ml，用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制，消化时间37℃ 20～40min。 • 链酶蛋白酶 0.1%，用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释，消化时间37℃ 1～4h。 • 无花果蛋白酶 0.1%浓度，用0.2M pH7.4 PBS稀释，消化时间37℃ 30～60min。

17. （二）抗体的选择 • 第一抗体（一抗）： • 高特异性、高效价、多克隆。 • 高特异性—针对性强，靶的明朗 • 高效价—稳定性好，反应时间长；适宜 • 稀释可减少干扰。 • 多克隆（动物免疫血清）— 针对多为 • 点，易检 • 出。

18. 市售抗体的种类 • 某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋白酶 • 有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。 • 近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性

19. 标记抗体 • 在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到 • 标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒 • 标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低

20. 抗体的保存 商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在4℃中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可10μl/支分装，标上号，-40℃保存备用。 • 抗体的配制

21. 抗体最佳稀释度的测定 直接测定法 一抗稀释度 特异性染色 非特异性染色 1:50 ++++ ++ 1:100 ++++ ++ 1:200 ++++ ++ 1:400 ++++ + 1:500 +++ (－) 阴性对照 (－) (－)

22. （三）抗原/抗体反应（温育） • 保证抗原/抗体反应有效进行的关键。 • 温度：37℃（60min）/4℃（过夜）/微波 • 炉（5min） • 湿度：湿盒 • 避光：～

23. （四）改善标本的通透性 • 通透性:指与大分子抗体反应时,其通过细胞 • 膜的能力。 • 通过表面去垢剂，如NP-40、TritonX-100使得细胞膜的通透性增强，或通过反复冻-融操作～ • 通透性处理的方式（试剂、浓度、时间）与标本固定方法相关。

24. （五）对照项的设立 • 设对照的意义：为排除各种可能干扰因素的影响，正确评估检测结果。 • 阳性对照：选已知某抗原阳性的切片等作同步检测操作，结果必须显示应当出现的阳性表现。 • 阴性对照：1、空白对照 • 2、替代试验 • 3、吸收试验

25. （六）检测结果的判断 • 阳性结果的定位明确，如细胞核（病毒）？细胞膜（受体）？细胞浆（表达蛋白）？ • 阳性结果的分布规律，特异性着色局限且有规律；非特异着色无规律、无界限，定位不准确。 • 阳性结果的强度～

26. 阳性患者标本 商品荧光二抗 自制荧光二抗(原液) 1:10 1:20 1:40 1:80 阴性患者标本

27. 二、酶免疫组织化学技术 • （一）酶标记抗体免疫组化染色法 • 1、直接染色法 （一步法） • 2、间接染色法（二步法） • （二）非标记抗体酶免疫组化染色法 • 1、酶桥联法 • 2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法 • 3、双桥PAP法 • 4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）

28. 二、酶免疫组织化学技术 • 酶标记抗体免疫组化染色法：指将酶通过交联剂共价连接在抗体分子上～酶标抗体 酶标抗体+切片上抗原～ +底物 酶催化底物等显色并沉淀其中，可定性、定位、定量。 酶标记抗体为一抗（直接） 酶标记抗体为一抗（间接）

29. （一）酶标记抗体免疫组化染色法 • 1、直接染色法 （一步法）： 原理：待检标本+酶标记抗体～+底物显色 技术要点：除内源性酶、封闭、镜下观察

30. 直接法 • 将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。 • 优点：特异性高、非特异染色轻。 • 缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记

31. Substrate-chromogene solution Secondary Antibody Primary Antibody 2、间接染色法 （二步法）： 原理：待检标本+非标记特异性一抗+酶标记 二抗～+底物显色 技术要点：同前

32. 间接法 • 将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗） • 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔 • 优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 • 缺点：特异性差

33. （二）非标记抗体酶免疫组化染色法 • 非标记抗体酶免疫组化染色中，酶不是直接标记在抗体（一抗/二抗），而是经抗酶抗体与酶结合，它既用于抗原检测，也可用于抗体检测。 • 常见的：1、酶桥联法；2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；3、双桥PAP；4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）

34. 1、酶桥联法:Ag-Ab1-Ab2-Ab(E)

35. 2、过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法: • 组成： • 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 • 二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 • 三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP）

36. 酶 — 抗酶抗体复合物 • 通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物（Peroxidase AntiPeroxidase Complex），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。

37. Substrate-chromogene solution Peroxidase-anti-Peroxidase Secondary Antibody Primary Antibody PAP

38. 特点： • ①未经化学交联不影响抗体和酶的活性 • ②由2个抗酶抗体和3个酶分子，稳定性好 • ③本身不存在游离免疫球蛋白，非特异少 • ④但复合物制备繁琐

39. 优点： • PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 • PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 • 可用于福尔马林固定的石蜡切片

40. 3、双桥PAP法: PAP的改良 • 呈Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP • 敏感性提高, 操作太复杂。

41. 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP 双PAP法

42. 4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP） • 与PAP法相似，其用的是碱性磷酸酶 • （AP）。 • AP代HRP-除内源性酶干扰，特异性高 • 成本高（制备过程复杂）。

43. APAAP法

44. 三、免疫电镜技术 • Immunoelectron microscope（IEM）技术是利用电子显微镜的高分辨力，能够清晰揭示抗原-抗体特异性复合物，呈现高度精确、灵敏且特异的结果。 • 标记（示踪）物：铁蛋白、胶体金等标记 • 抗体+抗原—不溶性复合 • 物～

45. 免疫电镜成功的关键： • ①细胞超微结构要求保存完好 • ②细胞或亚细胞结构的抗原位点保持不变 • ③免疫试剂应选择通透性好 • ④标记免疫物与待检抗原结合性好（特 • 异、稳定）

46. 三、免疫电镜技术（方法） • 1、铁蛋白标记免疫电镜技术 ①含铁25%，分子量450KD ②核心4个亚基，电子密度高 ③铁原子的电子散射力大，镜下反差大

47. 1、铁蛋白标记免疫电镜技术 • 原理：铁蛋白标记抗体，保留抗体免疫活 • 性并具高电子密度，与待检抗原结 • 合，在电镜下易见。 • 技术要点：①铁蛋白标记抗体的制备 • 标记方法：A、一步法 • B、二步法 • ②免疫电镜样本的制备 • 制备法：A、包埋前免疫染色 • B、包埋后免疫染色

48. 免疫电镜样本的制备中包埋前免疫染色： • 固定—免疫组化染色—包埋、切片镜检 • 免疫电镜样本的制备中包埋后免疫染色： • 固定—包埋、切片—免疫组化染色，镜检

49. 2、酶标记免疫电镜技术 电镜下酶标记免疫染色图

50. 酶标记免疫电镜技术是将电镜高分辨力与酶 免疫技术的高灵敏与特异性相结合～ 常用酶：水解酶 氧化酶（HRP）+ DAB（底物） 转化酶 DAB– 3、3二氨基联苯胺。易氧化聚合～系 列反应后+锇酸——高电子密度的锇黑。 技术分类:(用否酶标抗体、何时用？)