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生物电子显微学实验室 http://bioem.sysu.edu.cn 病毒结构生物学第三讲李鲲鹏、张勤奋中山大学生命科学学院 2010.03

关于蛋白质折叠的关键概念 • 蛋白质折叠是自发进行的 • 预测蛋白质结构是结构生物学的梦想之一 • 蛋白质既是稳定的，又是不稳定的 • 折叠过程的中间态：熔球态（molten globule） • 疏水侧链的包埋是一个关键事件 • 酶帮助形成合适的二硫键 • 脯氨酸异构化对蛋白质折叠的限速 • 分子伴侣 • 构象变化

蛋白质折叠途径

作业 • 分成两组，结合授课内容进行资料搜集与整理的训练，包含要点： • 把Telomeres与CDK的关系阐述清楚 • 关于细胞周期的研究进展写一个小综述 • 重点描述细胞周期研究中结构生物学相关的研究进展 • 每组40分钟讲演给两周时间准备（3.25轮空）； 4.1进行信息生物学方面的概论； 4.8对本次作业进行现场讲演

DNA的结构 B-DNA A-DNA Z-DNA

DNA序列专一识别码 B-DNA大沟和小沟中，碱基对边缘识别模式的颜色码，氢键受体红色，氢键供体蓝色，甲基基团黄色，氢原子白色三种内切酶Eco R1，Bal 1，Sma 1在DNA大沟内的序列专一识别位点： 1、模式的唯一性 2、回文结构

原核生物DNA识别机制 • Helix-turn-helix motif(hth) • Repressor and activator • Example:Bacteriophage 阻遏蛋白结合于结构基因的启动子，阻止RNA聚合酶结合，从而阻止转录启动，另一方面，激活蛋白结合于启动子的临近区域，帮助RNA聚合酶结合启动子，从而增加转录速率。 More information? Repressor and activator From Wikipedia

基因调控的分子机制 • 细胞正常条件下生长时，噬菌体是休眠的，噬菌体DNA作为细菌染色体整合的一部分被复制，但不表达；当细胞受紫外光照射时，噬菌体基因启动表达，产生噬菌体，裂解细菌。 • 下图为噬菌体基因组的开关元件，包含两个结构基因区和一个操作基因区(operator region,OR)，or1和or2与Cro蛋白启动子重叠,or2和or3与阻遏蛋白启动子重叠。但Cro-or3，Rep-or1均具有最高亲和力。 • 紫外线激活了一个蛋白水解酶RevA,降解阻遏蛋白，RNA聚合酶就有充分几率结合Cro启动子，而or3会有更多几率结合Cro蛋白，随着雪崩效应的开始，噬菌体表达开关被完全打开。

Recognition α helix • 阻遏蛋白单体的结构 • 阻遏蛋白二聚体的结构 • Cro蛋白的结构

3.4nm 模型构建

真实的复合物结构 • 蛋白质的结合使B-DNA构象发生轻微畸变 • 434阻遏蛋白的识别螺旋开始的两个谷氨酰胺残基是操作基因区的通用识别信号 • 对不同的结合区，有不同的亲和力，但亲和能力主要是由小分子来调节的

别构效应对蛋白结合DNA能力的调控 • 色氨酸结合于阻遏蛋白时的构象变化使得阻遏蛋白可有效结合DNA，此称小分子的别构效应（allosteric effect），这些小分子又称别构效应剂（allosteric effectors）

CAP介导的DNA弯曲 • CAP：catabolite gene activating protein,postive control protein, 参与糖分子降解，当乳糖降解产物出于低水平时，细胞内cAMP增加，CAP是非专一的DNA结合蛋白，但与cAMP结合后就可牢固结合于专一操纵基因区； • 结构研究表明： CAP-cAMP-DNA复合物的形成使得DNA发生大的弯曲，提高转录速率。

真核生物转录因子对DNA的识别 • 主要关注RNA聚合酶II（另外两个I和III分别转录编码rRNA和tRNA的基因） • 在RNA聚合酶II的起始位点之前有许多特定序列，每个序列由一种DNA结合蛋白（转录因子, transcription factors）识别，并组成控制模块（control module） • 控制模块的DNA部分可以分为三个区域：基本启动子元件（核心,core or basal promoter elements）、启动子近侧元件(promoter proximal elements)、远侧增强子元件(distal enhancer elements) • TATA box是最典型的核心，由TBP识别(TATA box-binding protein) • 当前起始复合物组装完成后，DNA双链在转录起始位点开始链的分离，RNA聚合酶II从启动子处释放，并启动转录 • Types of DNA-binding domains • Helix-turn-helix • Zinc finger • Leucine zipper • Helix-loop-helix

TBP的结构 • TBP中的beta片层构成DNA的结合位点 • TBP结合于DNA螺旋的小沟中，并引起DNA很大的结构变化 • TBP与TATA盒之间主要为疏水作用 • TBP引起DNA畸变的功能意义 • TA较之GC更易被调节，适应于DNA的形变 • TA之间堆积作用较弱，使DNA易于变形 • 弯曲既是TBP结合的效果，也是转录的需要

P53突变与肿瘤生成 • P53,肿瘤抑制基因，是控制细胞周期的关键因子：CDK为p21所抑制，而p21的表达由P53来启动，p21存在时，细胞分类停止，细胞获得充分时间来修复损伤的DNA，如果不能修复，则启动细胞的程序性死亡; • P53突变体可能因无法专一结合DNA序列从而无法激活由p53控制的基因转录，进而导致肿瘤的发生; • P53的DNA结合结构域是一个反平行的beta桶，与免疫球蛋白超家族具有相似的折叠模式，如HIV的受体CD4; • 结合DNA的区域是两个loop,L1，L3和一个SLH区(strand-loop-helix)的短螺旋，L2是维持与DNA结合时的正确构象所必须的，因此大多数致肿瘤突变都是发生在这些相关区域；

Zif motif 真核生物中的专一转录因子，其DNA结合结构域常见的有以下几种motif: 1、具有含锌结构的motif：Zif motif； a)经典Zif结构； b)双Zif结构； c)双Zn簇结构； 2、Zip motif:碱性区/亮氨酸拉链(b/zip)； 3、螺旋-环-螺旋：HLH； 4、b/HLK/zip

Xfin基因编码的经典Zfig motif • 本例是爪蛙Xfin基因编码的富含锌指结构的某一蛋白，多达37个串联重复的锌指结构； • 本图显示了指区与DNA相互作用的基本模式：2个专一相互作用，3个非专一相互作用； • His53,既参与非专一相互作用，也参与Zn配体形成含有三个锌指的AA序列，颜色编码同前例

单核双Zif结构 • 糖皮质激素受体的DNA结合域； • Zn与4个半胱氨酸结合； • 红色区域是与DNA专一结合的识别螺旋，紫色是参与形成二聚体的loop（D box）; • D box仅在结合DNA时，才形成SLH模体结构参与二聚体界面相互作用，这一结构变化即成为识别DNA的别构效应剂； • N端的识别螺旋专一识别DNA大沟，其二聚体间隔识别模式与原核生物阻遏蛋白的识别模式极为相似

双Zn簇Zif motif • GAL4转录因子激活降解半乳糖和蜜二糖所需的基因转录，分为二聚化区、接头区和Zn2C6锌簇区,其锌簇区结合于增强子元件的两端； • 接头区和锌簇区均参与DNA的结合，但专一识别位点仅为Lys18所对应CCG三联体，其他为非专一性识别位点；

Zip motif • 最早在酵母转录因子GCN4等蛋白中，提炼出亮氨酸拉链Leu Zipper模体; • Zip二聚体是coil coil motif的一种，其特点是：相互作用界面形成疏水核心(ad),外侧则为极性或带电残基(eg)；第四个残基为Leu(K)，由此得名； • Zip异二聚体提供了组合调控的分子基础，是真核细胞控制基因表达最重要的一种机制。 MAX GCN4 Fos Jun

b/zip motif • GCN4二聚体蛋白中，带电残基精氨酸和赖氨酸位于碱性区，参与构成DNA专一性作用位点； • 象双筷子，夹住DNA大沟；

HLH motif • HLH参与形成Zip; • 例子：生肌蛋白质MyoD为b/HLH motif;

b/HLH/zip家族 • Myc癌基因的恶性转化需要Max与Myc结合； • 转录因子MAX为b/HLH/zip motif； • b/HLH,b/HLH/zip两个家族的loop,无论在序列上还是在长度上，都是高度可变的

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