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植物基因克隆

植物基因克隆. 中国农业大学，郭仰东. 植物基因的克隆. 从广义上讲，克隆（ clone ）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌 (E. coli) 的 DNA 片段（或基因）的扩增，主要过程包括 目标 DNA 的获得 、 重组载体的构建 、 受体细胞的转化 以及 重组细胞的筛选和繁殖 等。. 转录起始点. 增强子. 终止密码子. 起始密码子. ----3 ’ UTR----. CAAT TATA. 5 ’ UTR. ATG. 内含子. TAG. AATAAA. 启动子. 终止子. 加尾信号序列.

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  1. 植物基因克隆 中国农业大学，郭仰东

  2. 植物基因的克隆 • 从广义上讲，克隆（clone ）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌(E. coli)的DNA 片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获得、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。

  3. 转录起始点 增强子 终止密码子 起始密码子 ----3’ UTR---- CAAT TATA 5’ UTR ATG 内含子 TAG AATAAA 启动子 终止子 加尾信号序列 --- 非转录调控区 --- ----------------------- 转录区 --------------- 第一节 植物墓因的结构和功能 一、植物基因的结构和特点

  4. 启动子（promoter ）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，包括三个较重要的区域， 1、转录起始位点（通常在+ 1 处） 2、转录起始位点上游25 – 40 bp 的区域， 3、转录起始位点上游 -75bp 处或以外区域． 植物基因的启动子

  5. 通常在植物基因转录起始位点上游约25bp 的区域内可找到一个所谓的TATA 盒( TATA box ) ，它是RNA 聚合酶II 的识别位点，同 时也是一些核蛋白与DNA 相互作用的位点 之一。

  6. 植物基因的增强子序列 增强子（enhancer ）是另一类调控基因表达的DNA序列，其中包含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件。反式作用因子和增强子内的顺式作用元件结合后能够调控（通常为增强）邻近基因的转录和表达。增强子序列一般位于基因的转录起始位点上游- 100bp ～ - 300bp处。

  7. 植物基因的起始子序列 起始密码子（AUG）前后的序列被称为起始子序列（initiator sequence )，它在核糖体识别和翻译的 启动中有重要作用，起始子序列的特性直接影响着 翻译过程中核糖体识别及翻译的效率。

  8. 植物基因的加尾信号序列在真核生物核基因的3’非翻译区（3 ’ untranslated region, 3’ UTR）内包括一段保守的序列AATAAA，它对于mRNA 转录的终止和加poly A尾是必不可少的. 这一保守序列和其下游的一段GT丰富区共同构成了polyA的加尾信号。 • 植物基因的密码子偏好虽然所有生物大多使用通用的密码子系统，但植物基因在同义密码子间的选择上有一定的偏好。研究表明，植物叶绿体和线粒体基因在同义密码子第三位上更偏好使用A 、U。

  9. 所谓载体（vector ）是一类能够携带外源DNA 片段进入寄主细胞内，并实现外源DNA 片段复制或表达的DNA 分子。按照载体的功能不同，可分为克隆载体和表达载体两大类。克隆载体的用途是在寄主细胞中扩增外源DNA 片段；表达载体的用途主要是在寄主细胞中实现外源DNA 的表达。按照载体的组成，又可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体和人工染色体载体等几种。 第二节 基因克隆常用的载体

  10. 一、载体必须具备的基本条件 ⒈具有独立复制能力 ⒉ 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) ⒊ 具有遗传表型或筛选标记 ⒋ 有足够的容量以容纳外源DNA片段 ⒌ 可导入受体细胞。

  11. 二、载体的分类 （一） 克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体。质粒DNA、噬菌体DNA （二） 表达型载体 为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。

  12. （一） 质粒 (plasmid)： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有 较高的拷贝数； 2. 具有1个以上的选择标记，便于筛选； 3. 具有多克隆位点。 三、常用的载体

  13. pBR322质粒 ① 4363 bp ② 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素基因(amp R) ④ 一个抗四环素基因 (tet R) ⑤ Amp R和tet R抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS )、TetR→Tet敏感(TetS).

  14. pUC系列质粒 由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2686 bp； （2） 有ampR和与M13噬菌体 相同的多克隆位点（MCS） （3）有一个来自E.coli的LacZ基因片断, 编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选

  15. (二)λ噬菌体 组成特点： 双链线状DNA分子， 全长约50 kb， 含66个基因， 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。

  16. λ噬菌体感染细菌后的两种生长途径 溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。

  17. 溶源性生长 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。

  18. λ噬菌体两种生长途径（示意图）

  19. 三、黏粒载体 黏粒（cosmid ）载体是一类人工构建的含有λDNA中cos序列及质粒复制子的特殊类型质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。 黏粒载体的大小一般为4 - 6kb，主要由多克隆位点区（MCS ）、包括cos位点在内的λDNA区、质粒复制起始区（ori ）和抗性选择标记区（selectable marker ）等几部分组成。

  20. 四、人工染色体载体 为了进一步提高载体的克隆能力，构建 人工染色体载体系统（artificial chromosome system ) ，比如酵母人工染色体、细菌人工染色体及人类人工染色体等。

  21. 人工染色体载体系统是复杂基因组研究中不可缺少的工具。一般来说，端粒（telemere , TEL ）、DNA复制起始区（autonomous replicating sequence , ARS ）和着丝粒（centromere , CEN ）是维持染色体正常功能所不可缺少的三类元件。 将酵母染色体的这三类元件及必要的选择标记基因克隆到质粒pBR 322中就构成了YAC 载体质粒，通过双酶切形成左右两臂，同外源大片段DNA连接后构成了YAC分子。转入酵母细胞后即为YAC 克隆。

  22. 第三节 基因克隆的工具酶 基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。

  23. 一、限制性核酸内切酶 (restrictionendonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶作用特性，一般分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型， 其中常用的是Ⅱ型限制酶。

  24. 限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点 特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构： 5ˊ－粘性末端 3ˊ－粘性末端 平端或钝端 回文序列(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈180度反向重复; 粘性末端(sticky end)是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。

  25. - G A A T T C - A A T T C - - G 5' 3' 3' 5' + G - G - 3' - C T T A A 5' 5' 3' - C T T A A EcoR I G - 3' G - - C T G C A - C T G C A 5' 5' 3' + 5' A C G T C - 3' 3' - G 5' A C G T C - - G Pst I ⑴产生5'-粘性末端 ⑵ 产生3'-粘性末端

  26. ⑶产生平(头末)端/钝端 同裂酶（异源同酶） 同尾酶 可变酶 其它特殊性质 的Ⅱ型限制酶

  27. 同裂酶（isoschizomers ）也称同功异源酶，是指那些来源不同，但能识别和切割同样的核苷酸靶序列的限制性核酸内切酶。同裂酶——同识同切

  28. 同尾酶（isoaudamers ）是指识别的靶序列不同，但能产生相同 黏性末端的限制性核酸内切酶。

  29. 常用限制性核酸内切酶的特性

  30. 限制性内切酶的应用 通过切割不同来源DNA双链的特异碱基序列，产生含有黏性末端或平端的、长度不同的DNA片段。用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。

  31. 二、DNA聚合酶 （最常用的DNA聚合酶有以下几种） DNA聚合酶Ⅰ（全酶） DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段 T4 DNA聚合酶 逆转录酶酶 Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）

  32. ㈠ DNA聚合酶Ⅰ E. ColiDNA聚合酶Ⅰ（DNA pol Ⅰ） 是一个具有3种酶活性的多功能性酶。 包括： 5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性

  33. DNA pol Ⅰ应用 ⑴ 常用来催化DNA缺口平移反应，制备 高比活性DNA探针； ⑵ cDNA第二条链的合成； ⑶ 对DNA 3突出末端进行标记； ⑷ DNA序列分析。

  34. （二）Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶） 作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围70  75℃， 2） 95℃以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。

  35. （三）逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase ）实际上是一种以mRNA 为模板的DNA聚合酶，其产物为互补DNA ( complementary DNA , cDNA )，这是基因克隆研究中非常重要的工具酶，主要用于cDNA 片段的合成。

  36. 三、DNA连接酶(DNA ligase) 催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。 DNA连接酶的用途 （1） 两个双链DNA片段连接起来 5ˊ- ACG AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ 3ˊ- TGCTTAA GCA-5ˊ 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ （2） 修补带有缺口的双链DNA分子 T4DNA连接酶

  37. 四、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase） 能够催化水解去除DNA或RNA 5ˊ-端的磷酸基团。 用途 ⒈ 制备载体时，用碱性磷酸酶除去载体分子 5ˊ－磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。 ⒉ 用32P标记5'-端前，除去5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。

  38. 重要的工具酶

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