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转基因动物

转基因动物. 黑龙江八一农垦大学生命学院. 转基因动物的制备 转基因动物应用前景 转基因动物研究存在的问题. 转基因动物： 应用实验胚胎学和分子生物学原理，将来自一种生物的特定基因导入另一动物的受精卵或早期胚胎细胞中，使其整合到宿主染色体中，在动物发育过程中表达，并能通过生殖细胞传递给后代。这种在基因组中稳定地整合有导入的外源基因的动物称转基因动物 (transgenic animal) 。. 应用： 利用转基因技术 建立人类疾病动物模型 加速动物育种 研究真核生物基因表达调控机理

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转基因动物

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Presentation Transcript

  1. 转基因动物 黑龙江八一农垦大学生命学院

  2. 转基因动物的制备 • 转基因动物应用前景 • 转基因动物研究存在的问题

  3. 转基因动物： 应用实验胚胎学和分子生物学原理，将来自一种生物的特定基因导入另一动物的受精卵或早期胚胎细胞中，使其整合到宿主染色体中，在动物发育过程中表达，并能通过生殖细胞传递给后代。这种在基因组中稳定地整合有导入的外源基因的动物称转基因动物(transgenic animal)。

  4. 应用： 利用转基因技术 建立人类疾病动物模型 加速动物育种 研究真核生物基因表达调控机理 在哺乳动物特异组织系统内生产药用蛋白等。

  5. 进展 20世纪70年代，Jaenish和Mints应用显微注射法，首次获得了SV40DNA转基因小鼠。 1982年，Palmiter等将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得了比普通小鼠生长速度快24倍、体型大一倍的转基因超级小鼠(supermouse)。 在随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因免、转基因羊、转基因猪、转基因牛、转基因鸡和转基因鱼等陆续育成。 这些开创性的工作，使人们在不同层次和不同角度立体地研究基因的功能，有目的地改良动物品种，为畜牧和水产养殖业服务。

  6. 第一节 转基因动物的制备 • 目的基因的来源 • 目的基因导入 • 转基因胚胎培养与移植 • 转基因动物鉴定

  7. 一、目的基因的来源 采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因； 通过mRNA合成cDNA； 人工合成的DNA片段； 聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。

  8. 二、目的基因导入 把目的基因成功地导入动物早期胚胎细胞中，是转基因动物研究的核心技术。 目前导入目的基因的主要方法有： • 电穿孔法 • 显微注射法 • 裸露DNA直接注射 • 磷酸钙—DNA共沉淀法 • 脂质载体包埋法 • 病毒介导的生物学方法

  9. 利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。 电穿孔法实现外源基因的转移

  10. 利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。 显微注射转基因技术

  11. 这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。 磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术

  12. 将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。 脂质载体包埋法

  13. 病毒介导的生物学方法

  14. 基因显微注射法 反转录病毒法 胚胎干细胞移植 精子载体法 核移植法 受体介导的基因转移等 三、转基因动物的方法

  15. 何为显微注射？显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。何为显微注射？显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。 （一）基因的显微注射法

  16. DNA显微注射法的基本程序（以小鼠为例） 通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48h后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵为35个； 与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵； 将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内 ； 将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ； 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ； 从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点 ； 子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达 。

  17. 通过DNA显微注射 获得转基因小鼠示图

  18. 1、显微注射DNA的制备与纯化 DNA构型 载体 DNA的长度与浓度 溶解DNA的缓冲液 DNA的纯度

  19. 2、鼠的准备与要求 转基因鼠实验所用各类鼠

  20. 3、超排卵与取卵 （1） 超排卵 孕马血清（PMSG）其有效成分为卵泡刺激素（FSH）。 人绒毛膜促性腺激素（hCG） 雌鼠的排卵时间：PM10.00~12.00 雄鼠的排精时间：PM10.00~12.00 受精一般发生在：AM1.00

  21. 制定排卵程序： (1) 于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5-l 0单位的PMS； (2) 过48h(第三天中午)腹腔内注入5-10单位的人hCG(注射后11-13 h 后排卵)； (3) 令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再 重用，但成功率下降； (4) 检查阴栓(第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现阴栓。

  22. （2） 受精卵的收集 (1)检查阴栓：有白色阴栓的小鼠可用，引颈处死动物： (2)取输卵管：剖开腹腔，取出输卵管，置入含有3ml培养液的60mm直径的瓶皿中； (3)取卵子；在20×或50×解剖镜下找到输卵管，在卵管膨大的壶腹部(于卵管开口近 处)隐约可见内含的胚卵，把胚卵团用尖摄轻轻压挤出，用吸管移入含有400l分离 液的表玻皿中； (4)另准备4—5个瓶皿，每皿内均充有胚胎培养基400 l并覆盖有厚8mm硅烷油或液 体石蜡层(Fisher产，研究用)，硅烷油和石蜡巳预先在5%CO2中置37℃1h做平衡 处理，覆硅烷油或石蜡层的目的是为防止培养液蒸发、散热和pH改变； (5)向含卵团表玻皿的分离液中加5 l新制备的透明质酸酶(透明质酸酶10mg／1ml分 离液，Sigma产)，把胚卵团消化分散开； (6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转移入培养皿中，通过硅油层接 种入任一培养液小滴中)，以清除酶的继续作用； (7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)， 此时的卵己可用作DNA注射之用。

  23. 4、 DNA显微注射 （1）制备持卵管与注射针 持卵管制备：在火焰灯上将微玻璃管拉成中间较细的约5~10cm长的一段，其口径约80~120m，用玻璃刀将其在离颈部2cm处切断，再把切口烧成如图形状，口径约15 m。将尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置，使变成如图所示角度。 注射针的制备：由拉针器制成，针的口径应低于1 m。

  24. （2） DNA注射 ①硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡 （厚约5mm）； ②加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100l为单元的小滴 数个，各滴间相距1-2cm(视小滴多少而定)； ③胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中； ④DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥， 重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml； ⑤于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10min)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口； ⑥ 把待注射用的DNA装入注射管中；

  25. ⑦在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养 液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继 之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部； ⑧调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵 细胞膜内(小鼠胚卵直径约10m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原 核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注 射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射； 注射细胞数量越多越好； ⑨用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待 注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种； ⑩ 镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。

  26. A.注射针使受精卵胞膜内陷但未能穿透 B.成功注射

  27. 5、体内移植 （1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用； （2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液， 排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)； 最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别； 吸入吸管中待移植的卵细胞

  28. （3） 麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)； （4） 剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒； （5） 使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm； （6） 轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入 输卵管内； （7） 把输卵管及周围组织送回腹腔内； （8） 仔细紧密缝合创口， （9） 再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。

  29. 6、显微注射法获得转基因鼠的成活率

  30. 优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何 病毒基因组片段，绝对安全 。 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不 表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺 失等；需显微操作仪，技术性要求强。

  31. 转基因鱼的制备 与哺乳动物不同，鱼类为体外产卵、体外受精和体外发育，因而不需要剖腹取卵和将转基因胚胎再移植到假孕养母子宫内等复杂的操作步骤。采用显微注射法将外源基因导人金鱼卵母细胞生发泡制备转基因金鱼的操作过程如下

  32. ①注射用针的制作：取直径1mm的毛纫玻璃管，在拉针仪上制备直径小于10um的毛细玻璃针，用于显微注射；①注射用针的制作：取直径1mm的毛纫玻璃管，在拉针仪上制备直径小于10um的毛细玻璃针，用于显微注射； ②DNA溶液的配制：用Holtfreter液（每升蒸馏水中溶解3.5g NaCl、0.5g KCl、0.1g CaCl2、0.2g NaHCO3)配成终浓度约40ng/uL的DNA溶液； ③卵母细胞的收集和体外培养：取雄鱼追逐的雌鱼，剖腹取卵巢，将分散好的卵母细胞用1ug／mL的17α—20β—二氢孕酮溶液于24℃处理1h以上，待生发泡移至动物极受精孔下方时，即可注射； ④显微注射：注射几皮升至几十纳升的DNA溶液，大约相当于104一107个基因拷贝。注射外源DNA的量太大对胚胎有毒性，太少则影响基因的整合率。 ⑤注射后卵母细胞的培养：于24℃培养约3h后，生发泡破裂，再继续培养8—9h后即可进行人工受精； ⑥人工受精：用尖头镊子去除卵母细胞的滤泡细胞后，立即加入精液受精； ⑦胚胎的培养：受精卵孵化成幼鱼，继续培养： ⑧转基因鱼的鉴定

  33. （二）胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。 • 它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。 • 可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。

  34. 通过胚胎干细胞获得转基因小鼠

  35. 1、ES细胞的建立与维持 动物的准备：取受精之后3.5d的母鼠分离鼠胚。 胚胎的分离和初培养：3.5d孕鼠 鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎 体外培养胚胎 4-6d后，离散ICM。 ICM的离散与ES的分离：分离ICM 酶解细胞团 培养离散细胞 ES细胞集落 ES细胞的扩增：离散ES细胞 置四孔培养板中培养 ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养

  36. 从鼠的胚细胞培养胚胎干细胞

  37. 2、ES细胞的基因组操作 将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。 这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。

  38. 与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2）与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2） • 转入的目的基因（TG） • 编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor） • 两个不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2） 正-负筛选法示意图

  39. 3、转基因ES细胞的筛选——正负选择法 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞： 通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。 负选择法筛选出特异整合型ES细胞： 如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选， tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。 正-负筛选法示意图

  40. 4、转基因ES细胞的检测

  41. 5、转基因小鼠的繁育 正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后就可以移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。

  42. 6、获得纯合的转基因鼠

  43. 优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。 缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产 仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件 需要大量资金投入的事情。

  44. （三）反转录病毒感染法 利用反转录病毒作为目的基因的载体，通过感染宿主细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物 。

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