Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas

1. Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas Isabel García Luque Departamento de Microbiología Universidad de Sevilla

2. Infecciones asociadas a dispositivos médicos • Aumento considerable de dispositivos médicos. Alta incidencia de infecciones. • Infecciones persistentes que responden poco/mal a tratamientos convencionales. • Resistencia/ tolerancia a los antimicrobianos.

3. Infecciones asociadas a dispositivos médicos.

4. Infecciones asociadas a dispositivos médicos

5. ¿Cómo actuar?: • Retirada/cambio del dispositivo. • Tratamiento antimicrobiano prolongado a altas dosis. • Reintervención difícil. • Única opción: tratamiento antimicrobiano. • Costes elevados

6. Actividad antimicrobiana –biocapas bacterianas • Huésped • Microorganismo. • Antimicrobiano. • DISPOSITIVO MÉDICO

8. Biocapas bacterianas: • Comunidad de microorganismos, incluidos dentro de una matriz extracelular, que se encuentran adheridos a una superficie o en una interfase y que poseen un estado metabólico diferente del de las bacterias de vida libre. • J.W.Costerton. TheBiofilm Primer

9. Formación de las Biocapas. Adherencia • Fase inicial: inespecífica, reversible. Interacciones a larga distancia (>150 nm). • Fuerzas de Van der Waals • Gravitación • Interacciones electrostáticas • Hidrofobicidad • Enlaces de hidrógeno • Enlaces covalentes • Interacciones iónicas • Hidrofobicidad • Moléculas bacterianas (adhesinas, GPS) • Fase secundaria: específica, irreversible. Interacciones a corta distancia (<3 nm).

10. Formación de las Biocapas. • Una vez adheridas, las bacterias comienzan a multiplicarse hasta que se desarrolla la biocapa madura.

11. En el proceso de desarrollo de la biocapa, se establece una comunicación entre las bacterias (quorum sensing). “Mecanismo bacteriano de comunicación intercelular controlando la expresión génica en función de la densidad celular”.

12. La estructura de la biocapa no es homogénea.

13. Eficacia de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas. • Penetrar a través de la densa matriz de la biocapa. • Mantener su actividad bactericida: • En las diferentes condiciones microambientales. • Frente a bacterias de crecimiento lento. • Presentar baja tasa de desarrollo de resistencias

14. Resistencia de las biocapas bacterianasa los antimicrobianos • Resistencia innata. • Mecanismos adicionales, diferentes a los de las bacterias planctónicas. • CMB biocapas >> CMB planctónicas. • Las bacterias recuperan rápidamente su sensibilidad cuando se liberan de la biocapa.

15. Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas: • Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida). • Alteraciones en el metabolismo bacteriano: • Baja tasa de crecimiento • Heterogeneidad fenotípica • Resistencia inducida por los biomateriales

16. Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas: • Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida). • Pseudomonasaeruginosa: alginato- imipenem y tobramicina. • Staphylococcus aureus: slime - glicopéptidos. • Actividad dependiente de la estructura /composición química de la biocapa y tamaño/composición química del antimicrobiano.

17. Estudios de Permeabilidad 1 MH agar. 2,4 Membranas de policarbonato. 3 Biocapas. 5 Disco de antimicrobiano JM Rodríguez-Martínez et al. 2007 ( modif. Anderl et al. AAC 2000)

18. 50% 50% 50% 50% Permeabilidad de CIP, AMC, FOS y SXT en biocapas de P. aeruginosa y E. coli

19. Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas: • Alteraciones en el metabolismo bacteriano: • Tasa de crecimiento reducida: • Pseudomonasaeruginosa/betalactámicos. • Staphylococcus epidermidis/ ciprofloxacino. • Diferentes condiciones microambientales: ácido/básicas, aeróbicas/anaeróbicas • P. aeruginosa /tobramicina. • Mecanismos convencionales de resistencia a los antimicrobianos.

21. Mecanismos de resistencia de las biocapas bacterianas: Resistencia inducida por biomateriales: P. aeruginosa y látex siliconizado: • La actividad de las carbapenemas disminuye en presencia de este biomaterial. (J MedMicrobiol 1997). • Relacionado con las OMPs (pérdida de oprD2). (AntimicrobAgentsChemother. 1999) • Inducida por el Zn liberado al medio. (AntimicrobAgentsChemother. 2003)

22. OMPs de P. aeruginosa: Efecto del zinc MC. Conejo et al.; Antimicrob Agents Chemother. 2003

23. CzcCBA: Bomba de expulsión responsable de la co-resistencia a carbapenemas y metales pesados. Perron K. et al. J Biol Chem 2004; 279: 8761-8768.

24. “Comparison of biofilm-associatedcellsurvivalfollowing in vitro exposure of meticillin-resistantStaphylococcusaureusbiofilmstotheantibioticsclindamycin, daptomycin, linezolid, tigecycline and vancomycin”.Smith et al. Int J AntimicrobAgents. 2009

25. Limitaciones estudios in vitro: • Formación proceso complejo: • Muchos factores. • Difícil reproducir in vitro. • Resultados controvertidos. • Cautela a extrapolar in vivo.

26. Métodos de estudio in vitro Modelos estáticos: • Formación de las biocapas: • Placas de microdilución. • Incubación de segmentos. • Exposición de la biocapa al antimicrobiano Ventajas: Muchos antimicrobianos, diferentes concentraciones. Inconvenientes: Modelo estático, tiempos cortos, poliestireno

27. MRSA MSSA >70% >75% Efecto de daptomicina sobre la formación de biocapas MRSE MSSE 70-90% >90% VISA 80% Roveta et al. Int J AntimicrobAgents 2008

28. Adherencia bacteriana a biomateriales plásticos Bacterias adheridas x 105/cm2 López et al. J. Med Microbiol. 1991.

29. Métodos de estudio in vitroModelos dinámicos Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar. Dispositivo de Robbins

30. Modelo dinámico Sevilla device • Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar. • Utilizar segmentos de catéteres.

31. Poliuretano. Biocapas de 24 h

32. Acero inoxidable. Biocapas de 96h.

33. Actividad de antimicrobianos frente a microorganismos Gram positivos resistentes

34. Daptomicina / Biometales • Cepas: • Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (ica +: productora de slime). • CMI: Daptomicina 0.5 mg/L Vancomicina 2.0 mg/L • Biomateriales: • Segmentos de catéteres de poliuretano (3 cm; 7 french). • Discos de acero inoxidable 316L (diámetro: 8 mm).

35. Poliuretano. Biocapas de 24 h * * * p<0.05 comparada con vancomicina

36. Acero inoxidable. Biocapas de 96h. * * * * p<0.05 comparada con Vancomicina

37. Figura 2. Microscopía electrónica de barrido de las biocapas de 72 horas de S. epidermidis sobre catéteres de poliuretano usando el dispositivo diseñado por nuestro grupo sin antimicrobiano (a) y expuesto a 7.5mg/L de daptomicina (b)a) b)

38. Linezolid / Biometales Actividad comparativa de linezolid y vancomicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.

39. Linezolid / Biometales Actividad de linezolid y vancomicina asociados a rifampicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.

40. Nuevas estrategias frente a las biocapas bacterianas Impedir la formación de la biocapa: • Bloqueando la adherencia: • Biomateriales impregnados con biocidas o antimicrobianos. • Moléculas antisentido que silencien los genes involucrados en la adherencia • Inhibidores del quorum sensing. Colonización Adherencia Adhesión inicial Adhesina-receptor Interacciones electrostáticas Transporte de masas Quorum Van der Waals Formación Sensing de Biocapa Interacciones hidrofóbicas BIOMATERIAL

41. Nuevas estrategias terapéuticas frente a las biocapas bacterianas Eliminar la biocapa formada: • Métodos físicos: corriente eléctrica de baja intensidad, ultrasonidos • Terapia fotodinámica (PDT)

42. Efecto del tiempo de incubación con hipericina en la actividad fotodinámica antimicrobiana frente a biocapas estafilocócicas.Sofía Ballesta1, Isabel García1, Yolanda Gilaberte2, Antonio Rezusta3, Álvaro Pascual1,4.Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina.Universidad de Sevilla1. Unidad de Dermatología, Hospital San Jorge, Huesca2. Departamento de Microbiología, Hospital Universitario Miguel Servet. Universidad de Zaragoza. Zaragoza3. Unidad de Enfermedades Infecciosasy Microbiología Clínica. Hospital Universitario Virgen Macarena. Sevilla4. Material y métodos • Cepas: S. aureus ATCC 29213 y ATCC 33591 (productora y no productora de slime) S. epidermidis ATCC 35984 (productora de slime). • Actividad de hipericina (0.04-500 uM): Bacterias en suspensión: 5 min de preincubación y dosis de luz de 8 J/cm2 (lámpara LED 602±10 nm; intensidad 24 mW/cm2, 10 min tto). Biocapas de 24 horas formadas sobre placas de poliestireno: Diferentes tiempos de preincubación 30 J/cm2 (30 min tto)

43. Resultados Bacterias en suspensión: Preincubación: 5 minutos. Dosis de luz: 8 J/ cm2 Cinco minutos de preincubación con hipericina 1µM fueron suficientes para eliminar los estafilococos en suspensión.

44. Resultados Biocapas estafilocócicas: Preincubación: 5 minutos. Dosis de luz: 8 J/ cm2

46. Conclusiones • Hipericina mostró un efecto bactericida dosis-dependiente frente a las biocapas de S. aureus y S. epidermidis. • La actividad de Hiperericina frente a las biocapas de S. aureus y S. epidermidis fue tiempo de preincubación y concentración dependientes • La reducción en la supervivencia bacteriana fue menor en la cepa de S. aureus productora de slime que en la no productora. • El efecto de la hipericina sobre las biocapas de S. epidermidis fue similar al observado en las biocapas de S .aureus no productor de slime.