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Il file PDB. Il file PDB. http://www.rcsb.org/pdb. Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n).

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il file pdb
Il file PDB

Il file PDB

http://www.rcsb.org/pdb

Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)

HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3

[…]

fisica24ore

slide2

tipo di

atomo

tipo di

amminoacido

coordinate

X

Y

Z

ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O

fisica24ore

slide3
1a3n

catena A

C

O

N

S

EME

Fe

fisica24ore

rasmol v 2 7
RASMOL v 2.7

http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm

fisica24ore

tecniche computazionali
Tecniche computazionali

TECNICHE COMPUTAZIONALI

L’utilizzo complementare di tecniche di tipo sperimentale e di tipo computazionale è l’approccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi biologici.

Questa considerazione riguarda in particolare gli aspetti strutturali del problema, ovvero la conoscenza della conformazione, o variazione di conformazione, di una molecola biologica in relazione alla sua attività.

fisica24ore

slide6

risoluzione spaziale misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi

risoluzione energetica analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa

risoluzione temporale i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione

Limiti delle tecniche sperimentali

fisica24ore

limiti delle tecniche computazionali
Limiti delle tecniche computazionali

Sistemi biomolecolari troppo complessi meccanica classica con funzioni di interazione semi-empiriche per descrivere le interazioni tra gli atomi di un sistema molecolare

Simulazione del comportamento di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (<NA) atomi o di gradi di libertà (di solito 102-105 atomi), per un limitato periodo di tempo (102-104 picosecondi) può essere simulato  piccoli sistemi, con tempi di rilassamento brevi

Campionatura limitata dello spazio delle conformazioni di una macromolecola utilizzo dei dati sperimentali per restringerlo

fisica24ore

alcune applicazioni
Alcune Applicazioni
  • In primis: conoscere la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola per comprendere, spiegare, e a volte anche modificare ed utilizzare, la sua attività biologica.

fisica24ore

slide10

Monitorare i cambiamenti strutturali indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili.

fisica24ore

slide11

Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione.

fisica24ore

slide12

Studiare le variazioni conformazionali provocate dall’interazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce l’attivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).

fisica24ore

slide13

Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva.

fisica24ore

slide14

Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio d’azione.

fisica24ore

modellizzazione molecolare
Modellizzazione molecolare

Modellizzazione Molecolare

fisica24ore

ipotesi termodinamica di anfinsen per proteine a singolo dominio
Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)
  • L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa
  • Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina

fisica24ore

diagramma di flusso della modellizzazione proteica
Diagramma di flussodella modellizzazioneproteica

Sequenza proteica

Dati sperimentali

Allineamento multiplo

di sequenza

Ricerca nelle

banchedati

Assegnazione

dei domini

Proteina

omologa

nella banca dati

PDB?

Predizione della

struttura secondaria

Predizione

del fold

No

Analisi della famiglia

del fold

E’ stato

predetto

un fold?

Allineamento delle

strutture secondarie

Modellizzazione

comparativa

Allineamento della

sequenza alla struttura

No

Predizione della

struttura terziaria

Modello tridimensionale

della proteina

fisica24ore

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Modellizzazione comparativa

(o per similarità di sequenza)

Permette di costruire la struttura tridimensionale di una proteina

sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con un’altra proteina

di struttura NOTA

che viene usata come STAMPO.

fisica24ore

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* aa identici

. aa simili

Passi fondamentali

1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e “stampo”

fisica24ore

slide23

5. Ottimizzazione del modello

Regolarizzazione di legami, angoli e torsioni

Eliminazioni di clash strutturali

Minimizzazione energetica

fisica24ore

meccanica molecolare
Meccanica molecolare

Meccanica molecolare

Comprende la DINAMICA MOLECOLARE,

la RICERCA DELL’ENERGIA CONFORMAZIONALE,

e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING).

fisica24ore

slide27

La forma più semplice dell’energia potenziale di una molecola è :

ENERGIA pot =

Energia di ALLUNGAMENTO dei legami

+ Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame

+ Energia di TORSIONE degli angoli diedri

+ Energia delle interazioni di NON-LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche

La meccanica molecolare considera gli atomi come sfere e i legami come molle.

Forma equazione + parametri = force field

fisica24ore

ricerca dell energia conformazionale
Ricerca dell’energia conformazionale

Ricerca dell'energia conformazionale di una molecola

Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)

  • L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa
  • Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina

fisica24ore

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La superficie dell'energia libera configurazionale di una proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono molti stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto vicina al minimo globale (problema della ricerca del minimo assoluto) 

fisica24ore

slide30

minimo globale dell'energia potenziale

risultante delle forze nulla

equilibrio

stato più popolato

Conformazione energeticamente preferita

fisica24ore

minimizzazione dell energia
Minimizzazione dell’energia

Minimizzazione dell'energia

Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà intramolecolari) che conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia più vicina (MINIMO LOCALE), usando il minor numero di calcoli possibile.

fisica24ore

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Strategie di ricerca del minimo globale

  • Campionamento energetico sistematico:

L’energia viene campionata ad intervalli regolari sull’intera estensione di ciascun grado di libertà (tipicamente rotazioni dei legami).

fisica24ore

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Annealing simulato:

riscaldamento ad alta temperatura che modifica la struttura superando le barriere energetiche, seguito da un raffreddamento lento.

fisica24ore

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Ricerca casuale:

campionamento che genera strutture in maniera casuale, le quali vengono poi minimizzate

  • Dinamica molecolare:

superamento delle barriere energetiche conformazionali (più basse dell'annealing) e analisi della stabilità strutturale.

fisica24ore

dinamica molecolare
Dinamica molecolare

Dinamica molecolare

Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio:

stabilità delle proteine

variazioni conformazionali

folding proteico

trasporto ionico

fisica24ore

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Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le accelerazioni degli atomi della molecola.

fisica24ore

slide37

La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell’ equazione del moto di Newton

Fi = mi  ai

per tutti gli atomi del sistema molecolare

Tenendo presente che la forza si può esprimere come gradiente dell'energia potenziale:

Fi = - dV/dri

si combinano le due equazioni e si ottiene:

- dV/dri = mi d2ri/dt2

che collega la derivata dell'energia potenziale alle variazioni di posizione in funzione del tempo ed è quella che viene integrata.

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Perciò per calcolare una traiettoria c'è bisogno:

  • delle posizioni iniziali degli atomi (coordinate atomiche)
  • delle velocità iniziali
  • delle accelerazioni

1. le posizioni inziali ri si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling;

2. le velocità iniziali vi si ottengono dalla distribuzione delle velocità ad una data temperatura;

3. le accelerazioni sono determinate dal gradiente dell'energia potenziale.

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Le posizioni e le velocità iniziali (t = 0) determinano le posizioni e le velocità a tutti gli altri tempi t.

In pratica si considerano intervalli di integrazione finiti Dt.Dt tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi molecolari  una simulazione di 100 ps coinvolge 105-106 intervalli di integrazione.

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slide40

Riscaldamento lento alla temperatura di simulazione

Riequilibrazione dell’energia tra gli atomi

Energia cinetica totale del sistema

Distribuzione iniziale di velocità vi

Sistema allo zero assoluto

Temperatura di simulazione desiderata

fisica24ore

slide41

Protocollo di simulazione

Struttura iniziale

rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali

Minimizzazione dell’ energia

nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole d’acqua

Solvatazione della proteina

Minimizzazione dell’ energia in presenza del solvente

per equilibrarlo con la struttura

si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura  nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata.

Fase di riscaldamento

la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia

Fase di equilibrazione

Fase di simulazione vera e propria

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analisi dei risultati
Analisi dei risultati

Analisi dei risultati

Campionamento periodico di coordinate (e velocità)

Calcolo dell’energia potenziale media in funzione del tempo

Calcolo della differenza con la struttura di partenza in funzione del tempo

Calcolo della superficie accessibile al solvente e del raggio di girazione, in funzione del tempo

Calcolo della struttura media

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riconoscimento molecolare
Riconoscimento molecolare

Riconoscimento molecolare

E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici.

Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA(Fisher e Ehrilch)

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La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici.

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Sviluppo di farmaci

Elemento chiave:

scoperta di composti guida nuovi e innovativi

Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la bioattività

fisica24ore

tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco
tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco

è di grande importanza l’identificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità

Tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco

  • Ricerca del composto guida (1-2 anni)
  • Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni)
  • Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni)
  • Test tossicologici (1-3 anni)
  • Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno)
  • Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni)

Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni

Costo totale: circa $ 500 000 000

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Screening sperimentale:

test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le proprietà strutturali del recettore

Metodi computazionali detti Rational Design:

si basano su informazioni strutturali del recettore e/o del ligando

Ricerca di nuovi composti guida

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De Novo Design

I nuovi compostivengono generati nel sito di legame a partire da atomi o frammenti preposizionati nel sito e che successivamente vengono trasformati in molecole intere da softwares specifici.

Screening Virtuale

Librerie di molecole (esistenti o ipotetiche) vengono analizzate cercando ligandi con caratteristiche in accordo con i requisiti del sito di legame

Docking

Metodi computazionali

Struttura 3D del recettore NON nota

Struttura 3D del recettore nota

Structure Based Drug Design

QSAR (Quantitaive Structure-Activity Relationship)

Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e l’attività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall’analisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore.

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Docking

Predice la struttura 3D di complessi proteina-ligando.

Trova il corretto modo di legame di un composto, tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni combinazione confomazionale ligando-recettore.

  • Tali funzioni valutano:
  • Complementarità fra superficie
  • Energia libera di solvatazione
  • Interazioni elettrostatiche e idrofobiche

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In conclusione...

  • Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per:
  • la modellazione di sistemi proteici
  • la comprensione dei processi biologici
  • la comprensione della relazione struttura-attività
  • la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici

Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e indirizzando le conoscenze sperimentali

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