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第四单元 酶联免疫检测技术

第四单元 酶联免疫检测技术. 实验一 酶联免疫吸附试验 （验证性实验）. 实验目的. 验证酶联免疫吸附试验的基本原理. 掌握双抗体夹心酶联免疫法的基本原理 掌握酶联免疫试剂盒的基本组成 熟悉酶联免疫操作方法. 实验内容简介. 酶联免疫吸附试验是最常用的酶联免疫分析技术，有四种基本类型：夹心法（双抗体夹心和双抗原夹心）、间接法、竞争法、捕获法。 本实验以双抗体夹心法测定乙型肝炎表面抗原（ HBsAg ）为例，验证酶联免疫吸附试验的基本原理。. 实验原理. 双抗体夹心法

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第四单元 酶联免疫检测技术

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Presentation Transcript

  1. 第四单元 酶联免疫检测技术

  2. 实验一 酶联免疫吸附试验 （验证性实验）

  3. 实验目的 • 验证酶联免疫吸附试验的基本原理 • 掌握双抗体夹心酶联免疫法的基本原理 • 掌握酶联免疫试剂盒的基本组成 • 熟悉酶联免疫操作方法

  4. 实验内容简介 • 酶联免疫吸附试验是最常用的酶联免疫分析技术，有四种基本类型：夹心法（双抗体夹心和双抗原夹心）、间接法、竞争法、捕获法。 • 本实验以双抗体夹心法测定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）为例，验证酶联免疫吸附试验的基本原理。

  5. 实验原理 • 双抗体夹心法 筛选两种抗-HBsAg（针对不同抗原表位），一种连接于固相载体制备酶标反应板；另一种标记过氧化物酶制备酶标抗体。测定时，待测抗原分别与固相抗体和酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体双抗体夹心复合物。

  6. 实验材料 • ELISA试剂盒 预包被抗体酶标反应板 系列标准品抗原 酶标抗体（抗HBsAg-HRPO） 质控血清 显色底物 终止液 浓缩洗液

  7. 实验方法 • 制备酶标板 • 包被 • 封闭 • 实验准备 • 标本编号 • 所有试剂平衡至室温 • 稀释洗液

  8. 实验方法 • 操作步骤 • 加标准品或待测样本，37℃温浴30 min； • 洗涤3~5次，加酶标记抗体； • 37℃温浴30 min； • 洗涤3-5次，加显色液A和显色液B； • 室温15 min，再加入终止液; • 读取A450nm

  9. 结果判断 • 绘制标准曲线 • 采用Logistic曲线拟合 • 剂量反应曲线

  10. 注意事项 • 准确使用微量加样器 • 所有试剂需平衡至室温 • 加入试剂或标本后需轻轻振荡 • 洗涤过程要标准化

  11. 实验讨论 • 问题: • HBsAg定量分析的临床意义？ • 酶联免疫吸附试验的注意事项？ • 如何检测抗-HBsAg？ 天津医科大学 李会强

  12. 实验二 酶免疫组织化学染色技术 （验证性实验）

  13. 实验目的 • 验证酶免疫组织化学技术的原理 • 掌握PAP-酶免组化法的检测原理 • 熟悉PAP-酶免组化技术操作要领

  14. 实验内容简介 • 酶免疫组织化学技术集抗原抗体结合的特异性、酶免疫分析的敏感性和组织化学技术的直观性特点为一体，常用于细胞鉴定、抗原定位、病理组织观察等方面。 • 本实验以辣根过氧化物-抗辣根过氧化物免疫组化技术检测成熟CD3+ T细胞为例，对这一技术的原理和操作流程进行验证。

  15. 实验原理 • 要点： • 特异性抗体识别抗原 • PAP复合物的放大效应 • 桥联抗体连接作用

  16. 实验材料 • 一抗（识别抗体）： 抗CD3抗体 • PAP复合物： 过氧化物酶 抗-过氧化物酶 • 二抗（桥联抗体）： 兔抗鼠Ig

  17. 实验方法 • 分离外周血单个核细胞 采用密度梯度离心法分离 • 制片 • 免疫反应 • 加一抗，37℃ 60 min • 洗涤玻片3次 • 同时加桥联抗体和PAP复合物， 37℃ 30 min • 洗涤玻片3次 • 加底物显色 • 镜检

  18. 注意事项 • 制片时，细胞均匀，密度适中 • 免疫反应过程中， • 洗涤充分 • 湿盒中反应，防止干片 • 镜检时，注意区分特异和非特异

  19. 结果分析 采用高倍镜观察计数。将待检载破片置普通光学显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色，计数200个细胞，计算CD3+细胞的百分比。

  20. 实验讨论 • 思考题： • 酶免疫组织化学技术的影响因素有哪些？ • 在酶免疫组织化学技术中，为何不直接将酶蛋白标记在抗体分子上？ • 酶免疫组织化学技术有何优点？ 天津医科大学 李会强

  21. 实验三酶联免疫试剂盒的研制 （设计性实验）

  22. 实验目的 • 熟悉酶联免疫试剂盒研制要点 • 抗原纯化与抗体制备 • 制备酶标记抗原（或抗体） • 方法选择与设计 • 筛选抗体（抗体匹配） • 优化反应条件

  23. 实验相关知识简介 • 理论知识 酶联免疫吸附试验 • 相关技术 • 蛋白纯化 • 酶标记化合物制备 • 酶标反应板制备

  24. 实验要求 • 题目： 假设需采用酶联免疫法测定某种肿瘤标志物，设计实验如何制备酶联免疫试剂盒？ • 要求： • 设计实验方案，绘制技术路线图 • 说明重要实验内容和实验方法

  25. 实施策略 • 重要环节： • 纯化抗原和制备抗体 • 方法学选择与设计 • 抗原抗体选择 • 抗体匹配（双抗体夹心法） • 确定工作浓度 • 优化反应条件

  26. 总结与讨论 • 问题： • 研制酶联免疫试剂盒需做哪些准备工作？ • 如何根据待测物质特性选择合适反应类型？ • 双抗体夹心法如何进行抗体匹配实验？ • 理想剂量反应曲线应具备哪些条件？ 天津医科大学 李会强

  27. 实验四 定量酶免疫分析中标准曲线的 数学模型 （设计性实验）

  28. 实验目的 • 掌握常用标准曲线数学模型 • 线性回归法 • logistic曲线拟合

  29. 实验相关知识简介 • 理论知识 • 基本变量 分析物浓度和信号强度 • 免疫分析的特殊性 待测物浓度影响反应速率 曲线拟合方式影响测定结果

  30. 实验要求 • 题目： • 根据所给数据，绘制标准曲线或得出数学模型。

  31. 实施策略 • 两种方式拟合 • 四参数Logistic曲线拟合 • Logit-log 直线回归

  32. 总结与讨论 • 问题： • 直线回归有几种常用方式？说明各自特点。 • 曲线拟合有几种常用方式？说明各自特点。 • 如何评价剂量反应曲线拟合方式？ 天津医科大学 李会强

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