Download
transkripsjon i eukaryoter n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Transkripsjon i eukaryoter PowerPoint Presentation
Download Presentation
Transkripsjon i eukaryoter

Transkripsjon i eukaryoter

171 Views Download Presentation
Download Presentation

Transkripsjon i eukaryoter

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Transkripsjon i eukaryoter Voet & Voet kapittel 33 + litt supplement Lagt på nett: http://folk.uio.no/oddsg/

  2. Oversikt • RNA polymerase I • proteinfaktorer og promoter/gen-organisering • RNA polymerase III • proteinfaktorer og promoter/gen-organisering • RNA polymerase II • proteinfaktorer og promoter/gen-organisering • Kromatin som medspiller 80% av total RNA syntese fra disse ”Oddpols”

  3. RNA polymerase I (RNAPI)

  4. Klasse I gener (rRNA) transkribert avRNA polymerase I (RNAPI) • RNAPI syntetiserer kun en type RNA: ribosomalt RNA • En trx enhet (7.5 kB) • Multiple tandem gener for å øke rRNA produksjonen • 50 - 10 000x avh av species

  5. Nucleoli • RNAPI lokalisert til nucleoli (ribosom-fabrikker)

  6. UPE Core Enhancere Terminator elementer Klasse I gener (rRNA):promoter-organisering • Repeterte gener med promotere imellom • Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter

  7. UPE Core Enhancere Terminator elementer Klasse I gener (rRNA):Hjelpefaktorer involvert • Repeterte gener med promotere imellom • Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter UBF UBF SL1 TTF-1 RNAPI

  8. RNA polymerase III (RNAPIII)

  9. Klasse III gener transkribert avRNA polymerase III • RNAPIII syntetiserer et fåtall ulike RNA som er små, stabile og ikke-translaterte • tRNA, 5S RNA, 7SL RNA, U6 snRNA ++

  10. Promotere - tre typer • Typer promotere • Type I: som i 5S rRNA genet, A-I-C blokker • Type II: som i tRNA genene, A+B blokker • Type III: atypiske uten intrageniske elementer A I C +1 +50 +64 +80 +97 +120 A B +1 +8 +19 +52 +62 +73

  11. Klasse III gener transkribert avRNA polymerase III • Promotere med intrageniske elementer • Mutasjoner endrer både promoter og produkt • Polymerasen må lese igjennom aktiverende trx-komplekser A-blokk B-blokk

  12. Klasse III gener: hjelpefaktorer involvert • Type II promotere - mest klassiske • Sekvens: TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC A B TFIIIB TBP

  13. Klasse III gener: hjelpefaktorer involvert • Type I promotere • en type gen, en spesial faktor TFIIIA • Sekvens: TFIIIA - TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC TFIIIA A I C TFIIIB TBP

  14. RNA polymerase II (RNAPII)

  15. Understanding transcription - Increasing complexity 80ties 70ties 90ties Today Lemon and Tjian 2000 Genes Dev. 14:2551-69

  16. Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II Mediator Signal RD RNAPII TF TAD TFIID DBD Transcription factors TBP Chromatin GTFs TATA Enhancer Promoter Nucleosomal template - chromatin modifying activities

  17. Språket: cis-elementene

  18. cis-elementenes funksjon = Templater for kompleksdannelse • The function of cis-elements is being templates for the assembly of multiprotein complexes

  19. core promoter • upstream regulatoriske element • Enhancere • Boundary elements • LCR - locus control regions Promoter organisering

  20. Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II • Subklasser RNAPII-promotere • mRNA-kodende • TATA+ • INR+ • både TATA og INR • uten TATA, uten INR • snRNA-kodende

  21. Noen typer cis-elementer • UPE - Upstream promoter elementer • Binder konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler • Lokalisert nær TATA/INR (innen ca. 200 bp) • Eksempler • CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) • GC-rike bokser - binder Sp1 • Regulatoriske elementer • 1. Responsive elementer • eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heast shock, glucocorticoider • 2. Celletype spesifikke elementer • Lokalisert innblandet med UPE

  22. Enhancere • Distale elementer - Enhancere • Øker kraftig aktiviteten av en promoter • virker over lang avstand, uavh. av orientering, upstream/downstream • Drosophila wing margin enhancer: 85 kb upstream TSS • Immunoglobulin Hm enhancer: i 2. Intron • T-cell receptor a-chain enhancer: 69 kb downstream • samme cis-elementer som proksimalt • multiple cis-elementer innen et lite område (50 bp - 1.5 kb) • cis-elementer for mange ulike faktorer • responsive/vevsspes avh av sammensetning

  23. Mediator Signal RNAPII TF TFIID TBP Chromatin GTFs TATA Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II

  24. Prokaryot  RNA polymerase II  ´  Eukaryot DNA-bindende • Core med aktivt sete • RPB1 (´-like)binder DNA • RPB2 (-like) binder NTP • RPB3 (-like) assembly factor • Felles subenheter • RPB5, 6 og 8 felles for RNAPI-III • Til forskjell fra prokaryot RNAP, er RNAPII ikke i stand til spesifikk promoter-gjenkjenning NTP-binding

  25. CTD - ”C-terminal domain” • Hale på største subenhet: (YSPTSPS)n • n = 26 i gjær, 52 human pol.II • hydrofil eksponert hale • Unik for RNAPII • Essensiell funksjon in vivo •  >50% letalt

  26. CTD- funksjon • Fosforylering: (YSPTSPS)n • Reversibel fosforylering på både Ser og Tyr • Fosforylering endres gjennom trx syklus • Kinasering skjer etter PIC assembly • defosforylering av fri pol eller ved terminering

  27. Fosforylerings-syklus

  28. CTD funksjon • Initiering • Rolle i “recruitment” av RNAPII til promoter • bare ufosforylert pol deltar i PIC-assembly • Promoter clearance • RNAPII går over i hyperfosforylert elongeringsmodus • CTD fosforylering bryter interaksjoner og RNAPII frikobles fra PIC • Elongering • Samtidig: CTD fosforylering danner nye interaksjoner med elongeringsfaktorer • En rekke nye CTD-bindende proteiner identifisert siste år med funksjoner i splicing og terminering • Tett kobling: transkripsjon - pre-mRNA prosessering

  29. CTD binder også en rekke faktorer Holoenzym = Mediator + core RNAPII • Mediator • RNA processering • RNAPII = ”mRNA factory” som utfører koblet transkripsjon, capping, splicing og prosessering av 3´-ende

  30. Mediator Signal RNAPII TF TFIID TBP Chromatin GTFs TATA Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II

  31. GTFs - generelle transkripsjonsfaktorer • Hjelpefaktorer som dirigerer RNAPII til promoter • Trinnvis assembly • Dannelse av PIC - pre-initiation complex

  32. 1. Trinn: TATA bindes av TBP • TBP binder TATA - sekvensgjenkjenning • minor groove kontakt • TBP binder også en rekke andre polypeptider • aktivatorer • TAFs (kalles da TFIID = TBP + TAFs) • GTFs (TFIIB, TFIIA) • TBP = universell TF involvert i alle 3 tr.systemene • TBP i SL1, TFIID, TFIIIB protein DNA

  33. TBP = sadel (med TATA som hest) • 3D: Sadel-struktur • Konkav innerside binder DNA i minor groove via 10-stranded antiparallelt b-sheet • Konveks overside binder prot via 4 a-helikser • stigbøyler (“stirrup”) på hver ende

  34. DNA TBP bøyer DNA (stakkars hest) Ikke slik, …….men slik

  35. RNA polymerasen gjenkjenner en GTF-bundet promoter TBP TFIIA TFIIB Dette protein-promoter komplekset er det som gjenkjennes av RNAPII

  36. PIC ”modnes” etter RNAPII binding TFIIH: multisubenhet med CTD-kinase + helicase for smelting

  37. Mediator Signal RNAPII TF TFIID TBP Chromatin GTFs TATA Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II

  38. PIC-dannelse stimuleres av transkripsjonsfaktorer • Dannelse av PIC styres av TFs som binder elementer oppstrøms • Aktivatorer med høy sekvens-spesifisitet • Rekrutteringspunkt for assembly av komplekser

  39. DBD N TAD C (Oppstrøms)Transkripsjonsfaktoer • Modulær oppbygning - iallfall2 domener: • 1. DBD - DNA-bindingsdomene • 2. TAD - transaktivatordomene • DBD: grunnlaget for gruppering i TF-familier • Sinkfingre, kjernereseptorer, helix-loop-helix, leucin-zippere,osv. • TAD ulike grupper • Tre klasser med ulike targets • sure domener (GAL4, steroid receptor) • glutamin-rike domener (Sp1) • prolin-rike domener (CTF/NF1) • Strukturløse i fri tilstand - 3D i kontakt med target?

  40. Mange ulike TFs • Konstitutive TFs • Konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler • Binder cis-elementer lokalisert nær TATA/INR • Eksempler • CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) • GC-rike bokser - binder Sp1 • Regulatoriske TFs • 1. Signal-responsive faktorer • eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heat shock, glucocorticoider • 2. Celletype spesifikke faktorer

  41. Konstitutive Sp1 binder GC-bokser • Noen eksempler

  42. Synergi - mange faktorer stimulerer bedre enn én alene • Mange kontakter gir mer effektiv PIC assembly

  43. Familier - oppdelt etter DBD struktur Zinc finger bHelix-Loop-Helix (Max) STAT dimer Leucine zipper (Gcn4p) p53 DBD NFkB

  44. FamilieSinkfinger proteiner • TFIIIA fra Xenopus var første isolerte og klonede eukaryote TF • Funksjon: aktivering av 5S RNA transkripsjon • Primærstruktur TFIIIA • Bygget opp som repetisjon 9x 30 aa minidomener + 70 aa unik region C-term • Hvert minidomene konservert mønster av 2Cys+2His • Hvert minidomene strukturert rundt et koordinert sink ion

  45. Sinkfinger proteiner • Sink koordineres av 2 Cys + 2 His • Antall fingre varierer: 2-37 • Antall medlemmer uvanlig mange • S.cerevisiae genomet: 147 • C.elegans genomet 535 • Flere hundre humane Zif gener

  46. 3D struktur av sinkfingre • Zif268 - første multi-finger struktur • Hver finger et minidomene med -struktur • major groove kontakt via -heliks i  • gjenkjenning av base tripletter

  47. Kjerne-reseptorer - en sinkfinger-variant • To ”sinkefingre” utgjør en samlet enhet • En finger kontakter DNA • Dimeriserer ved binding til DNA

  48. Kjernereseptorer • Stor familie hvor DBD binder 2 Zn++ via tetraedrisk mønster av Cys • Konservert DBD 70-80 aa • Medierer transkripsjonell respons på komplekse ekstracellulære signal • klassiske steroid hormoner sekretert fra endokrine celler  via blod  målcelle  diffusjon inn  binder reseptor  aktiveres  modulerer målgener • Evolusjonsmessig koblet til multicell.org

  49. Gal4p - enda en sinkfinger variant (6 Cys + 2 Zn)