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第二章 发育生物学研究技术 Aug. 23, 2006

第二章 发育生物学研究技术 Aug. 23, 2006. 一、传统的研究方法. 缺损方法 分离或外植 移植法 标记法. 1. 缺损方法. Wilhum Roux 的实验. 2. 分离或外植. 1910年 R.G. 哈里森把神经母细胞离体培养在凝固的淋巴液中，证明了轴突的来源并观察了在体外的生长情况。. Han ’ s. Driesch 的实验. 3. 移植法. 细胞移植. 神经嵴细胞迁移实验. 4. 标记法. 染料细胞标记. 荧光细胞标记. 命运图. 二、胚胎原位杂交. 三、胚胎免疫组化. 四、显微操作. 卵子注射 原核注射 体细胞核移植.

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第二章 发育生物学研究技术 Aug. 23, 2006

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Presentation Transcript

  1. 第二章 发育生物学研究技术Aug. 23, 2006

  2. 一、传统的研究方法 缺损方法 分离或外植 移植法 标记法

  3. 1. 缺损方法 Wilhum Roux的实验

  4. 2. 分离或外植 1910年R.G. 哈里森把神经母细胞离体培养在凝固的淋巴液中，证明了轴突的来源并观察了在体外的生长情况。

  5. Han’s. Driesch 的实验

  6. 3. 移植法

  7. 细胞移植

  8. 神经嵴细胞迁移实验

  9. 4. 标记法 染料细胞标记

  10. 荧光细胞标记

  11. 命运图

  12. 二、胚胎原位杂交

  13. 三、胚胎免疫组化

  14. 四、显微操作 卵子注射 原核注射 体细胞核移植

  15. 五、转基因动物

  16. 六、基因敲除

  17. 七、控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法七、控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法

  18. 后基因组时代＝功能基因组时代

  19. (一)、鉴定发育相关新基因的主要方法 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因； 分离时空特异性表达基因的方法； 利用基因序列同源性的克隆法；

  20. 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 突变体的类型 • 隐性突变； • 半显性突变； • 显性突变

  21. 突变类型图示

  22. 获得突变体的方法 • 自然群体中的突变体； • 化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚硝基脲 (N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)； • 外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座子利用等； • X－射线或 r－射线照射

  23. 化学诱变法 斑马鱼上ENU化学突变研究的成就

  24. DNA插入诱变法 GFP 由含 基因的反转录病毒插入引起突变 正常胚胎 突变胚胎 X GFP 基因 基因 X X GFP 完整的 基因使胚胎正常发育 基因被 基因破坏后胚胎异常发育

  25. 反转录病毒插入引起的突变的鉴定

  26. Expression of GFP in virus-infected fish germline Transient

  27. An example of mutational phenotypes

  28. 分离时空特异性表达基因的方法 • 获取特定组织：直接取材或转基因法取材； • 构建cDNA文库； • 从蛋白质到基因。

  29. 基因芯片/核酸杂交法

  30. 利用基因序列同源性的克隆法 • 用一个物种的基因直接做探针分离另一个物种的同源基因； • 根据多个物种的蛋白序列分离另一个物种的同源基因； • 根据同一基因家族的不同成员间的保守序列分离新的家族成员。

  31. (二)、基因表达的检测 • mRNA的检测 • 蛋白质的检测 • 启动子活性检测

  32. mRNA的检测 • Northern blot • Dot blot • RT-PCR • DNA Microarray • in situ hybridization

  33. Northern杂交的作用：检测基因的转录物的存在及是否发生了选择性拼接。Northern杂交的作用：检测基因的转录物的存在及是否发生了选择性拼接。

  34. mRNA的检测 原位杂交(in situ hybridization)

  35. mRNA的检测 利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱

  36. 蛋白质的检测 • 电泳法 • Western blot • 抗体染色法

  37. (三)、基因对发育的影响的功能性研究 • 基因敲除法(gene knockout) • 异位表达法(ectopic expression) • DsRNA interference (RNAi) • Antibody blocking

  38. 用基因敲除法研究基因的功能

  39. 转基因动物与基因的异位表达 • DNA注射； • RNA注射； • 病毒感染。

  40. 用组织特异性启动子控制外源基因的表达 绿色血液 绿色神经细胞

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