分子生物学实验基本技术

《分子生物实用技术》 分子生物学实验基本技术罗湘建中南大学肿瘤研究所 2012年3月

Molecular Biology Timeline 1869 DNA discovered by F. Meischer 1910 Genes on chromosomes; T.H. Morgan 1941 One gene-one enzyme, Beadle & Tatum 1944 DNA is genetic material; Avery, Mcleod& McCarty 1953 Structure of DNA; Watson, Crick, Franklin, Wilkins 1961 Discovery of mRNA; Brenner, Jacob & Meseleson 1966 Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana 1972 Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen 1973 1973 Discovery of reverse transcriptase; H. Temin 1977 Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert 1977 Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. 1982 Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman 1986 Creation of PCR; K. Mullis et al. 2001 Human Genome Project; Venter, Collins and many others

分子生物学技术是由传统生物化学、生物物理学、细胞生物学、遗传学、应用微生物学及免疫学等各专业技术的渗透、综合而形成的，同时也包含了数学、化学、物理学、计算机科学和信息学技术的广泛渗入，并在此基础上发明和创造了一系列新的技术，如DNA及RNA的印迹转移、核酸分子杂交、DNA克隆或重组DNA、基因体外扩增、DNA测序等，形成了独特的重组DNA技术及其相关技术；以及研究蛋白质一级结构、二级结构和三维结构与功能分析的技术，统称为分子生物学技术。分子生物学技术是由传统生物化学、生物物理学、细胞生物学、遗传学、应用微生物学及免疫学等各专业技术的渗透、综合而形成的，同时也包含了数学、化学、物理学、计算机科学和信息学技术的广泛渗入，并在此基础上发明和创造了一系列新的技术，如DNA及RNA的印迹转移、核酸分子杂交、DNA克隆或重组DNA、基因体外扩增、DNA测序等，形成了独特的重组DNA技术及其相关技术；以及研究蛋白质一级结构、二级结构和三维结构与功能分析的技术，统称为分子生物学技术。

核酸纯化技术 核酸定量技术凝胶电泳技术离心分离技术分子杂交技术序列分析技术蛋白表达检测纯化技术 ………………

质粒和噬菌体DNA的制备 原核细胞核酸的制备真核细胞基因组核酸的制备核酸的纯化及定量凝胶电泳技术核酸的酶学操作本章节介绍：

一质粒和噬菌体DNA的制备

质粒（plasmid)广泛存在于包括酵母在内的多种微生物中，在宿主细胞的染色体外以稳定的方式遗传。结构上它是一种双链环状的DNA分子。质粒（plasmid)广泛存在于包括酵母在内的多种微生物中，在宿主细胞的染色体外以稳定的方式遗传。结构上它是一种双链环状的DNA分子。 • 质粒能携带外源基因进入细菌中扩增或表达，是基因工程中广泛应用的基因运载工具，质粒DNA的制备是最常用的实验基本技术。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段，主要用作亚克隆载体。

提取质粒DNA的目的是将细菌质粒DNA与菌体DNA分开，并去除菌体残片及蛋白，以获取质粒DNA。提取质粒DNA的目的是将细菌质粒DNA与菌体DNA分开，并去除菌体残片及蛋白，以获取质粒DNA。 • 步骤：增殖细菌和扩增质粒→细菌的收集与裂解→获取质粒DNA→质粒DNA的纯化

1. 质粒DNA的小量制备 碱裂解法：对细菌的裂解、细菌染色体DNA和蛋白质变性充分，提取的DNA产量高、纯度好。煮沸裂解法小量制备的质粒DNA，可进行酶切、重组、转化等。

2. 质粒DNA的大量制备 • 碱裂解法 • SDS裂解法:大于15kb的质粒DNA容易被强烈的物理或化学作用破坏，常采用作用过程较温和的SDS裂解法 • 对于如哺乳动物细胞转染、转基因动物操作等，需进一步提高质粒DNA纯度。不但包括细菌染色体DNA、RNA及蛋白质的去除，而且还要选择质粒DNA的不同分子构形，纯化共价闭环（CCC)质粒DNA.

质粒小抽Protocol： 1.从平板培养基上挑选单菌落接种至1-4ml含抗生素液体培基中（不要超过4ml），37℃过夜培养； 2.取1-4ml过夜培养菌液（3ml菌液可得到约20μg质粒DNA），12000rpm离心2min，弃上清； 3.用250μl Solution Ⅰ(第一次使用试剂盒时，将RNase A1混浊液全部加入到Solution Ⅰ，均匀混合后4℃保存)充分悬浮细菌沉淀（注意不要残留细小菌块，可用Vortex剧烈振荡使菌体充分悬浮）； 4.加入250μl的Solution Ⅱ轻轻上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液（此步骤不宜超过5min）； 5.加入400μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min； 6.室温12000rpm离心10min，取上清。（此时4℃离心不利于沉淀沉降）（此时可将Elution buffer管60℃预热）

7.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上； 8.将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液； 9.将500μl的Rinse A 加入Spin Column中，12000rpm离心30min，弃滤液 10.将700μl的Rinse B 加入Spin Column中，12000rpm离心30min，弃滤液 11.重复操作步骤10 12.将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜中央处加入20μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer（最好在超静台内操作）,室温静置1min。（注：将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。 13.12000rpm离心1min洗脱DNA.

3. 质粒DNA的纯化和保存 聚乙二醇沉淀法：纯化的质粒DNA可用于细菌转化，酶切分析，尤其对碱裂解法提取的质粒DNA纯化效果更佳。氯化铯/溴化乙锭平衡离心法离子交换层析和分子筛层析

4. 质粒DNA的保存 • 短期：菌落以平板方式，4℃保存；长期：菌液-70 ℃保存于甘油或DMSO溶液中 • TE缓冲液中质粒DNA， 4℃短期；或-20 ℃、-70 ℃ 长期保存 5. 噬菌体DNA的制备 • 噬菌体（bacteriophage)是感染细菌的病毒，按其生活周期分为两种类型：一类为溶菌性，一类为溶原性。用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是λ噬菌体，一种是M13噬菌体。

二原核细胞核酸的制备

1. 原核细胞基因组DNA的制备 小量制备大量制备 2. 原核细胞基因组RNA的制备革兰氏阴性细菌RNA的制备革兰氏阳性细菌RNA的制备

三真核细胞基因组核酸的制备

1. 真核细胞基因组DNA的制备 较理想的DNA样品应满足： ① 不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ② 最大程度降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染； ③ 排除RNA分子的污染与干扰

原理经消化或剪切匀浆成单个细胞的真核组织细胞，在蛋白酶K、SDS、RNA酶作用下，消化破裂细胞膜与核膜，蛋白质变性并降解成小肽或氨基酸；DNA从核蛋白中游离，与蛋白质分开；同时RNA酶降解污染的RNA。利用饱和酚、氯仿抽提使蛋白质与DNA脱离，在高盐存在下用乙醇沉淀收集DNA，得到欲提取的DNA。

真核细胞DNA制备方法 1.血液淋巴细胞DNA的制备： (1)5-10ml 抗凝的全血，用30ml 0.2％的NaCl溶液溶血，放冰上10min，3,500×g离心10min; (2)细胞沉淀重复上述溶血步骤2-3次，直至红细胞被完全溶解。 (3)用1.5ml DNA抽提液(10mmol/L Tris·Cl，pH 8.0; 0.1mol/L EDTA，pH8.0， 20-100μg/ml 胰RNA酶，0.5%SDS)重新悬浮细胞团块，37℃，1h。 (4)加蛋白酶K至终浓度为100-600μg/ml。混匀后，37℃过夜。(5)用等体积苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提一次。 (6)重复步骤(5)2-3次。 (7)氯仿抽提一次，加0.1体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5体积的冰乙醇，10，000×g，15min回收DNA。 (8)75％的乙醇洗一次，室温干燥，TE溶解，4℃保存。用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。

组织标本DNA的制备： (1)使用匀浆器： (2)在液氮低温下，将组织标本研磨成粉末： A.在液氮低温下，将组织标本研磨成粉末； B.将组织标本粉末加入DNA抽提液(10mmol/L Tris·Cl，pH 8.0; 0.1mol/L EDTA，pH8.0， 20-100μg/ml 胰RNA酶，0.5%SDS)中，振荡混匀，(按100 mg标本/1ml抽提液) 37℃，1h； C.下列步骤同血液淋巴细胞DNA的制备； (1)血液标本、组织标本要新鲜； (2)试剂PH值要准确（如苯酚等）； (3)DNA中蛋白质的污染：PK的活性、苯酚∶氯仿抽提 (4)测OD值、凝胶电泳检测 • 培养细胞DNA的制备： • 注意事项

2. 真核细胞总RNA的制备 • 真核细胞RNA的种类： tRNA: 约占15%； mRNA: 约占5%； rRNA: 约占80% • 制备方法： TRIzol试剂提取细胞总RNA 异硫氰酸胍法制备总RNA 细胞质RNA的制备

真核细胞总RNA制备前的准备工作： （1）玻璃器皿：180℃干烤>3h; 或用氯仿浸泡15min (注意：氯仿有毒）；（2）塑料器具：0.1%DEPC处理水浸泡过夜(注意：DEPC有毒）；或用氯仿浸泡15min；（3）试剂配制： 0.1%DEPC处理水：1000ml蒸馏水中加入1ml DEPC，充分搅拌溶解（过夜）；配制试剂的DEPC处理水：高压蒸气挥发掉DEPC； 75%乙醇：用DEPC处理水配制； TAE: 3M NaAc: MOPS:

透明上清 蛋白红色图1 用TRIzolTM试剂（Gibco BRL公司）制备真核细胞总RNA： (1)用PBS洗细胞1 ~3次，倒去残留的PBS; (2)加入适量的Trizol试剂（1ml/106个细胞）裂解细胞，裂5min。(3)吸入1.5ml离心管中，加入氯仿(0.2ml/ml Trizol)，振荡15s,静置2 ~3min。 4℃ 12,000×g离心15min； (4)吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10min， 4℃ 12,000×g离心10min; (5)去上清，加入1ml75%乙醇洗涤沉淀， 4℃ 7,500 ×g离心5min; (6)去上清，室温风干5 ~10min ； (7)加入10~20μl经DEPC 处理的H2O中，充分溶解（冰上放置20-30min）; (8)取1μl测OD值，测定其浓度; (9)取1μl在1% agarose凝胶电泳，测定其质量。

组织标本RNA抽提程序 (1)在1.5ml tubes中加入0.9 ml TRIzol试剂； (2)在液氮低温下，将约50~100mg的组织标本研磨成粉末（尽量磨碎）后，加入0.1ml TRIzol试剂，研磨成粉末； (3)将磨碎的组织标本加入上述1.5ml tubes中，剧烈震荡30sec，放置5min； (4)每1 ml TRIzol加入0.2ml氯仿，充分混匀，放置3min； (5)4℃12000×g离心15min； (6)吸取上清，加入0.5ml异丙醇，混匀，放置10min； (7)4℃12000×g离心10min；

(8)去上清，加入1 ml 75%酒精； (9)置-70℃保存。或4℃7500×g离心5min； (10)尽量吸去上清，空气干燥5-10 min； (11)加入10~20μl经DEPC 处理的H2O中，充分溶解（冰上放置20-30min）； (12)取1μl测OD值，测定其浓度； (13)取1μl在1% agarose凝胶电泳，测定其质量。

注意事项： (1)RNA的降解：RNase的污染； (2)A260/A280比值在1.7 ~2.0之间。比值低于1.7,表明有蛋白质污染，可采用酚：氯仿再次抽提； (3)凝胶电泳：28S和18S的比值约为2：1，表明RNA未降解； (4)RNA中的痕量DNA污染：用DNase I消化。 (5)加入氯仿上下颠倒混匀后，冰上置5min；离心吸取上清（见图1）（注：不要吸入蛋白）转移到另一无DNase及RNase管内

1. 总RNA 2. rRNA, tRNA 3. mRNA

Poly(A)RNA的纯化： 利用mRNA 3’端含有Poly(A)的特点，在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当在低盐溶液或蒸馏水的情况下，mRNA就被洗脱下来。

Poly(A)RNA的纯化的原理图

四核酸的纯化及定量

1. 核酸的纯化 DNA的酚抽提和乙醇沉淀玻璃珠法纯化DNA 丁酸浓缩DNA

2. 核酸的定量 荧光分光光度法测定核酸浓度在波长260nm紫外线下，1 OD值的光密度相当于50μg/ml的双链DNA，40μg/ml的单链DNA或RNA，30μg/ml的单链聚核苷酸，根据此特性来计算核酸样品的浓度。 DNA浓度(μg/ml)=A260×50×稀释倍数 RNA浓度(μg/ml)=A260×40×稀释倍数

2. 核酸纯度的测定 • DNA/RNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。 • DNA的A260/A280应在1.7-2.0之间，低于1.7，则表明有蛋白质的污染，可再次酚：氯仿：异戊醇抽提去除蛋白污染 • RNA的A260/A280比值应接近2.0较好。

核酸的贮存： DNA样品：溶于TE,4℃贮存。对于哺乳动物细胞DNA长期保存可加1滴氯仿，以避免细菌和核酸酶的污染 RNA样品：溶于pH5.2 0.3mol/L乙酸钠液或双蒸水中，-70℃贮存

五凝胶电泳

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳. 1937年首创纸电泳技术后，电泳的种类和应用在深度和广度两方面均迅速发展，已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选的标准方法。

原理 电泳法：指带电荷的样品（蛋白质、核酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。

凝胶电泳 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。DNA凝胶电泳中常使用琼脂糖和聚丙烯酰胺这两种介质，它们浓度的变化所形成大小不同的分子筛网孔，可分离不同分子量的核酸片段。琼脂糖孔径大，可以分离100bp-60kb的DNA分子；聚丙烯酰胺凝胶孔径小，用于分离5-500bp的小分子量DNA效果好。

等电点：DNA pI=6.0-7.0 支持介质：琼脂糖、PA 分离范围：agarose：100bp～60kb PA：5～500bp F=q × E F’= 6πrην F= F’, ν=qּE/ (6πrη) 泳动率（电泳迁移率）：单位电场强度的泳动速度 U= ν /E =q / (6 π rη) =(d/t)/(V/L) （cm2/V ּ S）迁移率单位：10-5 （cm2/V ּ S）球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。

电泳影响因素 1. 样品DNA物理性质质粒构象： CC＞L ＞OC 线形：㏒10M正比1/U (U:泳动率） 2. 介质性质㏒10U= ㏒10U0-KrT U：泳动率；U0：自由泳动率；Kr：介质阻滞系数； T：凝胶浓度。 3. 电压：5v/cm, 电场强度：V/L 4. 缓冲液离子强度：0.02～0.2 (I＝(ΣCZn)/2） C：溶液mol浓度；Z：化合价；n：原子数目。 TAE、TBE、TPE

5.电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。

1. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶可分离相差100bp的DNA片段，是实验室最常用的核酸的分离、鉴定和提纯的主要方法

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

2. 从琼脂糖凝胶中分离和纯化DNA限制性酶切片段电洗脱法低熔点琼脂糖分离DNA片段在琼脂糖主链中导入羟乙基修饰后，其凝固温度降为30℃，融化温度为65℃，这一熔化温度低于大多数DNA双链变性温度。利用低熔点琼脂糖熔点低纯度高的特点，可以方便得到适合DNA连接、探针标记和酶切反应的DNA

完全消化DNA样品 1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，刀片切下目的DNA片段条带 65℃熔化凝胶条，加TE至琼脂糖浓度≤0.4% 加等体积缓冲液平衡酚剧烈混合5-10min, 15800g室温离心，除去琼脂糖收集水相，TE缓冲液再次抽提酚相及中间界面，15000g离心5min,合并两次抽提水相乙醇沉淀，用Elutip-d柱纯化DNA，37℃保存DNA液

2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离和纯化小的DNA片段特点：分辨率高，即使最大的片段比最小的片段长500倍，也能很好分离；载样量大：在1cm×1cm胶孔中能上样10μg的样品回收DNA的纯度高凝胶抗腐蚀性、韧性强 • 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳此方法可分离和纯化单链DNA片段，它是在尿素或甲酰胺等核苷酸碱基配对抑制剂的存在下进行。应用于DNA测序，测定DNA的长度和回收寡核苷酸。

六核酸的酶学操作

分子生物学实验基本技术

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