FIA "flow injection analysis"

1. FIA"flow injection analysis" • Osnovne skupine višenamjenskih mjernih sustava koje su razvijene za nadzor i upravljanje biotehnoloških procesa su: • "on-line" protočni analizatori ("continuous flow autoanalysers") • "on-line" HPLC ("high performance liquid chromatography") • "on-line" maseni spektrometar • "on-lin" FIA ("flow injection analyser")

2. Automatizacija postupka mjerenja s PC računalom i integracija pripreme uzorka sa sustavom za dobivanje mjernog signala (detekciju) dovela je do razvoja skupine mjernih sustava pod nazivom FIA "flow injection analysis". Shematski prikaz gibanja injektiranog uzorka kroz kapilaru u mjernom sustavu FIA. FIA su on-line mjerni sustavi koji imaju izuzetne odlike kao što su veliko mjerno područje, visoka točnost mjerenja i stabilnost tijekom dugog rada. Osnova mjernog postupka je automatsko injektiranje malog uzorka u tok kapljevine prenosioca. Uzorak prvo prolazi kroz automatski vođen postupak pripreme uzorka i zatim se pronosi do sustava za dobivanje mjernog signala

3. Zavisno od primjene koriste se različiti postupci pripreme (čišćenje, razređenje, filtracija, ekstrakcija, itd.), a mjerni signal se najčešće dobiva u kemijskim i biokemijskim reakcijama, enzim-termistorima, tekućinskim kromatografima (HPLC), masenim spektrometrima, imunološkim reakcijama, biosenzorima, mikrobiološkim elektrodama, itd. Za prijenos optičkog mjernog signala koriste se optička vlakna ("fiber optics"). Automatsko vođenje pomoću računala omogućuje sinkronizacija rada pumpi, ventila, mjernih aktuatora, termostatiranje, regulaciju protoka, automatsku kalibraciju, i statističku analizu mjernog signala.

4. FIA mjerni sustavi imaju vrli široku primjenu u biotehnologiji i ostalim područjima. Neki primjeri primjene su: • nadzor i vođenje biokemijskih reaktora • -određivanje: glukoze i ostalih šećera, biomase, etanola, ukupnog • dušika, sumpora, fosfora, aktivnost enzima • analiza pitke vode • mjerenje sastava otpadnih voda • mjerenje sastava (šećera) u hrani • - analiza krvi

5. Na slici prikazan je FIA mjerni sustav za mjerenje koncentracije glukoze u bioreaktoru. Tijekom većeg dijela šaržnog procesa koncentracija glukoze u bioreaktoru je vrlo mala i njezino mjerenje klasičnim postupcima je složeno i netočno. Primjenom FIA sustava omogućeno je mjerenje vrlo visoke klase točnosti i širokog mjernog opsega, od vrlo malih do velikih koncentracija. FIA sustavom upravlja računalo koje se može programirati za automatsko uzimanje uzorka, na primjer 1 uzorak svakih 10 minuta. Vrlo mali uzorak podloge i stanica se pomoću peristaltičke pumpe izvlači iz bioreaktora i odmah se u kapilari dovodi u kontakt s inhibitorom NaN3 kako bi se zaustavila reakcija potrošnje glukoze. Inhibirani uzorak se injektira u tok kapljevine nosača (pufer) koji prenosi uzorak do ćelije u kojoj se nalazi membrana za filtraciju. Stanice i krute čestice se odvajaju iz uzorka, a otopina glukoze prolaz kroz membranu i prenosi se do enzimskog reaktora s nepokretnim slojem. U reaktoru se nalazi nepokretni sloj nosača u obliku malih kuglica (Sepharose 6B) na koji je vezan enzim glukoza-oksidaza (GOD). Tijekom oksidacije nastaju kao produkti glukonat/glukonska kiselina i vodikov peroksid. Produkti iz reaktora se prenose do statičke miješalice gdje se miješaju s indikatorom (fenolftaleinom). U reakciji oksidacije nastaje oksid-fenolftalein kojemu se dodaje bakreni sulfat. Nastaje otopine crvene boje čiji intenzitet se mjeri u protočnom spektrofotometru na valnoj dužini λ = 534 nm.

6. Slika 9. FIA mjerni sustav za mjerenje koncentracije glukoze u bioreaktoru (B. Mattiasson, et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 52 (1999) 502-507.

7. Umjeravanjem intenziteta (integrala) impulsa svjetla i koncentracije glukoze dobije se linearna statička karakteristika karakteristika u cjelokupnom mjernom području uz vrlo visoku točnost. Cijeli postupak se učestalo ponavlja tijekom rada bioreaktora uz veliku postojanost točnosti mjerenja. Nakon velikog broja uzoraka (> 1000) potrebno je zamijeniti sloj s GOD enzimom. Glavni reakcijski koraci:

8. Najvažnije značajke: volumen uzorka 50 μL protok 2 mL min-1 inhibitor natrijev azid NaN3w = 0,3 % pufer (octena kiselina/ natrijev acetat 0,01 M, pH 5,6) fenolftalein 0,015 M bakreni sulftat 0,4 g L-1 mjerno područje 0,1 - 104 mg L-1 maksimalna pogreška 0,1 mg L-1 klasa točnosti 0,001 % vremenska konstanta τ = 30 s stabilnost više od 1000 uzoraka

9. Protočni "citometar" ("flow cytometer") Za off-line i on-line analizu jednostaničnih mikroorganizama razvijeni su vrlo sofisticirani mjerni sustavi koji se zasnivaju na primjeni elektromagnetskog zračenja (laseri, IR, NIR, Raman, fluorescencija) za ispitivanja fizikalnih i biokemijskih značajki pojedine stanice ali i cjelokupne populacije. Tijekom zadnjih desetak godina su, uglavnom za off-line mjerenja razvijeni, protočni "citometri" ("flow cytometer"), shematski prikaz na slici 11.

10. Stanice iz posude za uzgoj stanica (bioreaktor) uz pomoć pumpe kontinuirano protječu kroz citometar. Mlaz kapljevine (podloga sa suspendiranim stanicama) se hidrodinamički kolimira u žarište instrumenta. Žarište je obasjano monokromatskim elektromagnetskim zračenjem iz lasera. Snop svjetlosti iz lasera u žarištu ima vrlo mali presjek, 0,1-1 μm, i prolazi okomito na smjer protjecanja stanica, tako da obasjava jednu po jednu stanicu koje protječu kroz žarište. Dio zračenja se rasprši na površini (membrane) stanice, a dio zračenja se apsorbira u stanici. Molekule u stanici na nekoliko različitih mehanizama, specifičnih za građu pojedine molekule, reemitiraju elektromagnetsko zračenje. Laserski snop iz žarišta prolazi kroz niz leća i refleksija na ogledalima kojima se usmjerava na niz fotoćelija sa foto-multiplikatorima za analizu. Stanice nakon prolaska kroz žarište prolaze kroz elektrostatsko polje između ravnih pločica za preusmjerivanje kretanja. Promjenom elektrostatskog polja stanica se može usmjeriti na jedni od više kiveta u kojima se stanice akumuliraju. Procesom defleksije stanice upravlja računalo koje prima mjerne signale iz fotomultiplikatora iz razvrstava stanice na osnovu neke programibilne značajke (npr. veličine, morfologije, viabilnosti, količine RNA, količine nekog metabolita, itd.). Daljnjom analizom stanica skupljenim u kivetama može se odrediti raspodjela populacije s obzirom na izabrani kriterij selekcije.

12. Brzina obrade informacije pomoću računala omogućuje veliku brzinu obrade mjernih signala, na primjer omogućuje analizu 104 stanica u 1 sekundi. Velika brzina analize ima za posljedicu visoku značajnost statističkih procjena velikog broja značajki populacije mikroorganizama, kao što su: makroskopske značajke - određivanje koncentracije biomase - raspodjela veličina stanica - ispitivanje morfologije stanica populacijske značajke - ispitivanje staničnog ciklusa - ispitivanje viabilnosti stanica - ispitivanje dinamike populacije (kvasac) intracelularne značajke - mjerenje intracelularne DNA, RNA, proteina, lipida - određivanje aktivnosti intracelularnih enzima, npr. aktivnosti β-galaktoze primjene u genetičkom inženjerstvu - broj plazmida i određivanje stabilnosti propagacije u populaciji - ekspresija gena - selekciju sojeva

13. Posebne mogućnosti se ostvaruju primjenom fluorescentnih bojila koji se dodaju supenziji sa stanicama. Određene fluorescentne tvari oboje određene skupine intracelularnih molekula, npr. proteine. Fluorescentno zračenje iz pojedinih stanica može se detektirati i kvantificirati u protočnom “citometru”. Značajni su primjeri on-line fluorescencije u UV području. Kada se živa stanica obasja s UV zračenjem valne dužine λ = 366 nm dolazi do apsorpcije na reduciranim molekulama piridin nukleotida (NADH, NADPH). Ekscitirane molekule reducirajućih ekvivalenata reemitiraju UV zračenje s maksimalnim intenzitetom na valnoj dužini λ = 400 nm. Intenzitet UV zračenja iz stanice je direktno proporcionalan intenzitetu metabolizma stanice, odnosno fiziološkog stanja. Nove mogućnosti nastaju kada se fluorescentno svjetlo dobije iz produkata metabolizma i na taj način ostvari istraživanje "in-vitro" enzimske kinetike. Primjenu su također našle kemoluminscencija za mjerenja ATP u stanicama, i bioluminisncija nekih mikroorganizama.

14. Biosenzori Biosenzori su skupina mjernih osjetila koji imaju kao aktivnu komponentu osjetila biološkog porijekla, npr. enzim, proteini, antitijela, kompleksi enzima, dio stanice, cijela stanica mikroorganizma, biljne i animalne stanice, itd. Njihov razvoj je motiviran povezivanjem izuzetnih specifičnosti reakcija biološki aktivnih tvari i suvremenih poluvodičkih elektroničkih komponenata za detekciju i analizu signala. • Važnije skupine biosenzora su: • enzim-termistori • enzim-elektrode • mikrobiološke elektrode • imunoelektrode • optoelektrode • FET i ISFET biosenzori

15. Enzim-termistori su minijaturni kalorimetri koji pretvaraju toplinu enzimske reakcije u promjenu otpora poluvodiča. Najpoznatiji je primjer enzim termistora za mjerenje koncentracije glukoze s vezanim enzimom glukozo-oksidazom na poluvodičkom peletu (opisano u poglavlju o otporničkim termometrima). Enzim-elektrode povezuju mogućnosti elektrokemijskih ćelija i aktivnostima enzima. Enzimi su mobilizirani na vanjskoj površini membrane elektroćelije. Enzimi u reakciji sa specifičnim supstratom daju mjerljiv produkt, npr H+ ion, ili troše O2 čiju koncentraciju elektroda pretvara u električni mjerni signal. Na primjer, razvijene su enzim elektrode za mjerenje koncentracije glukoze, masnih kiselina, aminokiselina, ugljikohidrata, fenola, i drugih tvari.

16. Mikrobiološke elektrode se izvedene na istom načelu kao i enzim-elektrode. Na površini membrane elektrode imobilizirane su stanice mikroorganizma. Mjerni signal nastaje elektrokemijskom pretvorbom nekog specifičnog produkta metabolizma stanice, na primjer respiracije stanice, stvaranje H+ iona, CO2, H2, itd. Imuno-elektrode imaju primjenu u medicini ali i u biotehnološkim procesima. Koriste se za detekciju i mjerenje koncentracije antigena. Budući da reakcijom antitijela i antigena ne nastaje novi produkt, nije moguće to reakciju pratiti na istom načelu kao za enzimske reakcije. Shematski prikaz mjernog osjetila je prikazan na slici 12.

17. Shematski prikaz rada imunoelektrode. Oznake: A anoda, K katoda, M membrana, Ab1 antitijelo-1, Ab2 antitijelo-2, Ag antigen, S supstrat, P produkt, E enzim. Osjetilo se sastoji od elektrokemijske elektrode (na primjer Clark-ove elektrode) na čijoj membrani s vanjske strane koja je u kontaktu s uzorkom su imobilizirana antitjela (na slici 12.1 označeni s Ab1) za detekciju određenog antigena. Antigen (označen s Ag) veže se na imobilizirana antitjela stvarajući kompleks antitjelo-antigen (slika 12.2). Budući da u interakciji ne nastaje produkt na osnovu kojeg bi se dobio mjerni signal, potrebno je upotrijebiti sekundarnu enzimsku reakciju.

18. Da bi se dobila sekundarna reakcija koriste se antitjela (na slici Ab2) s vezanim enzimom (oznaka E) koja tvore kompleks s vezanim. Nakon reakcije antitjelo-antigen, elektroda se dovodi u kontakt s uzorkom drugog antitjela s vezanim enzimom. Na površini membrane nastaje kompleks Ab1-Ag-Ab2-E. Mjerni signal se dobije u trećem koraku kada se elektroda izloži reakcijskom mediju sa supstratom ( označen s S na slici 12.3). Supstrat se transformira na vezanom enzimu E pri čemu dolazi do stvaranja produkta P. Produkt enzimske reakcije difuzijom prolazi kroz membranu elektrode i reakcijom s elektrolitom daje električni mjerni signal. Budući da je koncentracija produkta proporcionalna koncentraciji vezanog enzima, odnosno antigena, mjerni signal je direktno proporcionalan količini antigena u uzorku. Ovaj mjerni postupak ima uspješnu primjenu u detekciji hepatitisa B i C u krvi.

19. Optičke elektrode (opto-elektrode) su izvedeni primjenom optičkih vlakana i elektromagnetskog zračenja (npr.UV svjetlosti). Mjerno osjetilo (slika 13) sastoji se od optičkog vlakna koje na mjernom kraju u kontaktu s uzorkom imaju membranu na koju se može imobilizirati enzim za određenu reakciju kojom se detektira neka molekula (označena sa S na slici 13). Drugi kraj vlakna povezan je s izvorom UV zračenja valne dužine λ = 366 nm. Shematski prikaz opto-elektrode. I izvor UV zračenja valne dužine λ = 366 nm, D detektor fluorescentnog zračenja λ = 400 nm, E enzim, S supstrat, P produkt

20. Svjetlost se prenosi kroz vlakno i obasjava uzorak u kojem, na primjer, dolazi do bisupstratne rekacije s koenzimom NAD+. Reakcijom dolazi do redukcije koenzima i stvara se NADH koji intenzivno re-emitira (fluorescencija) UV zračenje na valnoj dužini λ = 400 nm. Svjetlo fluorescencije prenosi se kroz isto optičko vlakno do priključka s detektorom. Mjerni signal je intenzitet fluorescencija koja je proporcionalna koncentraciji NADH odnosno ciljane molekule S. Opto-elektrode mogu se lagano sterilizirati u vlažnoj atmosferi pri temperaturama T = 120 0C i tlaku p = 1,2 bar. Većina razvijenih biosenzora nije prilagođena uvjetima sterilizacije u bioreaktoru.

21. ISFET i FET biosenzori s izvedeni kao "interface" između bioloških i poluvodičkih materijala u svrhu mjerenja (FET field effect transistor, ISFET ion selective field effect transistor). Biološka komponenta je dio osjetila koji ima zadaću prepoznavanja pojedine molekule, a poluvodički dio osjetila pretvara promjenu nastalu biokemijskom reakcijom u električnu struju (amperometrijski) ili napon (potenciometrijski) pretvornik ("transducer"). Povezanost biološke komponente (enzimi, antitijela, stanice) ostvarena je imobilizacijom na površini poluvodiča koji je prekriven slojem polimera s aktivnim mjestima za fizikalnu ili kemijsku (kovalentnu) imobilizaciju. Biološki dio senzora je u kontaktu s uzorkom i ima zadaću biokemijskog prepoznavanja ciljane molekule.

22. Elektronički ekvivalentni krug ISFET (FET) biosenzora. Do biokemijske reakcije dolazi na površini polimera koja ima selektivnu propusnost iona (npr. prolaze samo H+ ioni ). U skladu s Nernestovim zakonom dolazi do razlike potencijala na površinama. Potencijal polimera djeluje neposredno kao potencijal mrežice triode ili PNP tranzistora (ekvivalentna shema na slici 15). Zavisno od mjernog sklopa pretvornik može biti potenciometrijski, signal EMS(mV), ili amperometrijski, signal I (mA).

23. Primjeri: 1) ISFET biosenzor za ureu potenciometrijski mjerni signal: EMS na površini polimera polipirola zavisno od koncentracije H+ iona. 2) ISFET biosenzor za mjerenje koncentracije penicilina, imobilizirani enzim penicilinaza 3) U prehrambenoj industriji: FET biosenzor za određivanje svježine mesa (mjerenje koncentracije ATP), imobiliziran enzim ksantan-oksidaza