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第二章：基因工程的工具酶

第二章：基因工程的工具酶. 基因工程的工具酶（ instrumental enzyme of gene engineering） 是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体 DNA 制备等所需要的酶类。. 核酸酶：能够将聚核苷酸链的 磷酸二酯键 切断的酶，属于水解酶 。. 核酸酶的分类： 1）根据核酸底物分 RNA 酶 （ Rnase）、 DNA 酶 （ Dnase） 和 底物非专一性核酸酶 ； 2）根据作用方式分 内切核酸酶 （ endonuclease） 和 外切核酸酶 （ exonuclease） ；

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第二章：基因工程的工具酶

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  1. 第二章：基因工程的工具酶

  2. 基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。

  3. 核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。

  4. 核酸酶的分类： 1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）、DNA酶（Dnase）和底物非专一性核酸酶； 2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）和外切核酸酶（exonuclease）； 3) 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）和非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）

  5. 在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。 限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA ，维护自身遗传稳定的保护机制。

  6. 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 用于核酸操作的工具酶 DNA连接酶 核酸修饰酶 核酸酶

  7. 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 HindⅡ和HindⅢ

  8. 限制性核酸内切酶 限制修饰 多功能 单功能 双功能 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 I 型 II 型 III 型 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处

  9. 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 Haemophilus influenzaed嗜血流感杆菌d株 H i n dⅢH i n dⅡ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶

  10. 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 EcoR Ⅰ的切割位点 EcoRⅠ的识别序列 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’

  11. 回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。 • 在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。

  12. 限制性核酸内切酶的切割类型： • （1）两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段； • （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

  13. EcoRⅠ等产生的5’粘性末端 5‘ … G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C … 5’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoRⅠ 37 ℃ 退火 4-7 ℃ OH P 5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’ P OH

  14. PstⅠ等产生的3’粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstⅠ 37 ℃ 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 退火 4-7 ℃ OH P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ P OH

  15. 5‘ … G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C … 5’ PvuⅡ等产生的平头末端 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ PvuⅡ 37 ℃

  16. 位点偏爱（site preference） 某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。

  17. 星号活性（star activity） 又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。

  18. 同裂酶 (isoschizomers)有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。 例如，XmaI（C CCGG G） SmaI（CCC GGG）

  19. 同尾酶  (isocaudamers) 来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。常用的BamHⅠ，BclⅠ，BglⅡ，XhoⅠ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端。

  20. 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件： Tris-HCl 50 mM pH 7.5 0 - 50 mM 低盐酶 MgCl2 10 mM 100 mM 中盐酶 NaCl 0 - 150 mM DTT 1 mM 150 mM 高盐酶 Volume 20 - 100 ml T T 37 ℃ 1 - 2 hr 1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全 水解 1 mg 标准DNA所需的酶量

  21. 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意： BamHⅠSmaⅠ 5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’

  22. 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 3 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 -20 ℃冰浴 30 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥

  23. 限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间

  24. 限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的甲基化程度： 识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性 因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌株

  25. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA的分子结构 某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自身处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。

  26. 限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 核酸内切酶的缓冲液性质： 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等， 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即 所谓的Star activity现象 EcoRⅠ在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘 油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’序列

  27. 酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+ 。 • 缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下，其功能最佳。 • 巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。

  28. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 酶切消化反应的温度 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况。

  29. 限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamH I和HaeⅡ具备对热稳定性，则需加入终止反应液（加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L 以螯合Mg2+）。

  30. 限制性核酸内切酶的特点 • 识别位点的DNA序列具有回文结构； • 切割DNA均产生含5’磷酸和3’羟基的末端； • 错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端；

  31. 限制性核酸内切酶的应用 • 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片断； • 用限制酶切割产生的相同粘末端以便重组； • 建立DNA的限制酶切图谱； • 构建基因组文库。

  32. 利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤： • 不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。 • 以下是对0.2—1.0 ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。

  33. 1) 加入合适体积的DNA溶液； 2) 加入2ul适当的10X限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁以混匀之； 3) 加入1－2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之； 4) 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育； 5) 加入0.5M/L EDTA（pH8.0）使终浓度达10mM／L，以终止反应； 6) 如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入6ul凝胶电泳加样缓冲液混合后，再加样进行电泳。 如欲纯化酶切后的DNA，可用酚和氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA。

  34. 使用限制酶的注意点： • 1）限制酶十分昂贵! 为能从贮存管内取出极少量的酶，只要用移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可，这样可以取到少至0.1ul的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶变性。 • 2)限制酶在50％甘油中保存于-20℃时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其它酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。 • 3)尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小，但要确保酶体积不超过反应总体积的1／10，否则，限制酶活性将受到甘油的抑制。 • 4)通常延长消化时间可使所需的酶量减少，这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反应液进行电泳以判断消化程度。

  35. DNA聚合酶 DNA聚合酶作用的特点： （1）要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA； （2）接受模板指导； （3）需要有引物（3’羟基）的存在； （4）不能起始合成新的DNA链； （5）催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端； （6）催化DNA的合成方向是5’—3’。

  36. DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质： 5’→3’的DNA聚合酶活性 5’→3’的核酸外切酶活性 3’→5’的核酸外切酶活性 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-OH DNA pol I 5‘ ppp dN Mg2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH

  37. DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途： 缺口平移： 5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进 Nick translation 制备DNA探针

  38. DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端 三分之二的大肽段，即为Klenow酶 Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核 核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性

  39. DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列

  40. DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端 5‘ … G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C … 5’ Klenow dATP dTTP 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’

  41. DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记 5‘ … G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C … 5’ Klenow a-32P-pppdATP dTTP 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’

  42. DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本特性： 5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性 在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

  43. DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ T4-DNA聚合酶 5‘ … G-C-T-C- OHP-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-PHO -C-C-T-C … 5’ 注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多

  44. DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记 5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ T4-DNA pol 5‘ G-C-T-C A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ T4-DNA pol Mg2+ 5‘ ppp dNTP a-32P-dATP 5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘

  45. DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶的基本特性： 5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性 已知DNA聚合酶中持续合成能力最强 改造后成为双脱氧终止法对长片段DNA的测序酶

  46. DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶的基本用途： 用于拷贝长段模板的引物延伸反应 通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记

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