制药微生物发酵技术

1. 制药微生物发酵技术 Pharmaceutical microbial fermentation technology —工作过程导向课程 —“教学做”一体模式 天津职业大学 生物制药专业 ENTER

2. 项目1 项目2 项目4 项目3 项目5 制药微生物发酵技术 制药微生物发酵技术----课件

3. 种子的制备和扩大培养 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 1 3 制药微生物发酵技术 1-3谷氨酸发酵工艺过程控制 2 微生物细胞数的计数和菌浓的测定

4. 制药微生物发酵技术 告知： 1.学会使用血球计数板计数单细 胞微生物的数量。 2.熟悉5L发酵罐的结构和操作。 3.掌握亚硫酸盐氧化法测定KLɑ。

5. 制药微生物发酵技术 引入（任务项目） 谷氨酸的产量，第三关键取决于菌种生长过程中的条件 ？

6. 制药微生物发酵技术 操练 提出扩培概念→提出种子逐级扩大培养流程→菌浓的测定

7. (1)熟识好氧细菌的扩大培养技术。 (2)了解谷氨酸发酵(好氧发酵)的方法及发酵条件对代谢产物的影响。 (3)学习用纸上层析法与比色法对谷氨酸进行定性与定量测定。 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

8. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 (1)菌种：黄色短杆菌。 (2)培养用原材料：葡萄糖，玉米浆，尿素，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸锰，硫酸亚铁，琼脂。 (3)仪器、设备、试剂： ①接种环，酒精灯，试管，三角瓶，烧杯，恒温培养箱。 ②恒温培养室，摇床，分光光度计。 ③层析缸，新华一号滤纸，标准谷氨酸，0.5％茚三酮，正丁醇，甲酸，氨水，乙醇，硫酸钠。

9. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 1)菌种的扩大培养 (1)培养基的制备。 ①试管斜面培养基： 葡萄糖0.1％ 牛肉膏1％ 蛋白胨1％ 氯化钠0.5％ 琼脂2％ pH6.8～7.2 ②三角瓶扩大培养基： 葡萄糖2.5％ 玉米浆2.5％ 尿素0.5％ 磷酸氢二钾0.15％ 硫酸镁0.04％ 硫酸锰2mg/kg 硫酸亚铁2mg/kg pH7.0

10. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 (2)接种与扩大培养。 ①将试管斜面原菌移接于试管活化斜面培养基上，以30～33℃培养24h。 ②将上述培养好的斜面菌种接一环于三角瓶培养基中，以32～34℃的温度摇床振荡培养10～12h。 ③成熟种子的质量要求 2)谷氨酸发酵试验 (1)培养基的制备。同种子培养基的制备。将制备好的灭菌培养基在无菌条件下分装于已经灭过菌的500mL三角瓶中，每瓶装100mL。

11. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 (2)接种与发酵。将培养好的成熟种子接种于上述发酵培养基中，接种量为1％～2％(视种子质量而定)。 3)谷氨酸发酵条件试验 (1)谷氨酸发酵最适碳、氮比例试验。 ①发酵基础培养基配制： 玉米浆3％ 磷酸氢二钾0.17％ 硫酸镁0.06％ 硫酸锰2mg/kg 硫酸亚铁2mg/kg pH7.0 (2)玉米浆对谷氨酸发酵的影响

12. 一、种子扩大培养的任务 二、种子制备的过程 ⒈ 孢子制备 ⑴ 放线菌孢子的制备 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法 摇瓶菌丝进罐法 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

13. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 • ⑵ 霉菌孢子的制备 • ⒉ 种子制备 • ⑴ 摇瓶种子制备 • ⑵ 种子罐种子制备 • 比较：种子制备的目的和发酵的目的

14. 种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。 种子罐级数减少，有利于生产过程的简化及发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

15. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 酵母菌的三级培养过程

16. 三、种子培养 ⒈ 表面培养法 ⒉ 固体培养法 ⒊ 液体深层培养 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

17. 四、种子质量的控制 ㈠ 影响孢子质量的因素及其控制 ⒈ 培养基 ⒉ 培养温度和湿度 例如：龟裂链霉菌斜面 ⒊ 培养时间和冷藏时间 ⑴ 孢子的培养时间 ⑵ 孢子的冷藏时间 ⒋ 接种量 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1

18. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 • ㈡ 影响种子质量的因素及其控制 • ⒈ 培养基 • ⒉ 培养条件 • ⒊ 种龄 • 在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。 • ⒋ 接种量 • 双种法；倒种法；混种法

19. 种子的制备和扩大培养 1 5L罐对数期（32h） 5L罐延迟期（4h） 5L罐稳定期（48h） 5L罐衰亡期（68h） 摇瓶衰亡期（72h） 制药微生物发酵技术 分批发酵条件下，黄色短杆菌TK0303的菌体形态变化 训练项目1

20. 种子的制备和扩大培养 1 放线菌 制药微生物发酵技术 训练项目1 • ⒌ 种子质量标准 • ⑴ 细胞或菌体 • ⑵ 生化指标 • ⑶ 产物生成量 • ⑷ 酶活力 • ⒍ 种子异常的分析 • ⑴ 菌种生长发育缓慢或过快 • ⑵ 菌丝结团 • ⑶ 菌丝粘壁

21. 种子的制备和扩大培养 1 制药微生物发酵技术 训练项目1 霉菌菌丝 菌丝团

22. 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2 一、项目指导 血球计数板是一块比普通载玻片厚的特制玻片制成。玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其它平面略低，中央有一小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格。中间的一个大方格为计数室，它的长、宽各为1mm，深度为0.1mm,容积为0.1mm3。计数室有两种规格，一种是把大方格分成16个中格，每一中格分成25小格，共计400小格；另一种规格是把大方格分成25中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。

23. 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2 血细胞计数板正面、侧面与正面方格放大示意图

24. 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2 因此，在计算上可按下列两种公式进行： 1. 16×25计数板的计算： 细胞数/mL= （100小格内的细胞数/100）×400 ×10000 ×稀释倍数 2. 25X16计数板的计算： 细胞数/mL= （80小格内的细胞数/80）×400 ×10000 ×稀释倍数 式中，400为计数板的小格总数； 10000为由计数室0.1mm3换算成lmL体积的系数

25. 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2 二、材料和用具 1.材料 酵母菌悬液 2.用具 显微镜、血球计数板

26. 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2 三、方法 1.取清洁干燥的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。在显微镜下找到计数室。 2.取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴(不宜过多)。菌液可自行渗入计数室。计数室不得有气泡，然后置高倍镜下计数。

27. 3.样品浓度要求每小格内有5～10个菌体为宜。 4.计数时，用16×25的计数板要按对角线方位，取左上、左下、右上，右下四个中方格(即100小格)计数酵母菌液，用25×16的计数板，除计数上述对角线的四个方格外，还需数中央一个方格的酵母菌数(即80小格)。 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2

28. 5.每个样品重复计数2～3次，取其平均值，按上述公式计算每毫升菌液所含的酵母细胞数。5.每个样品重复计数2～3次，取其平均值，按上述公式计算每毫升菌液所含的酵母细胞数。 6.计数完毕，将计数板在水龙头上冲洗，切勿用硬物洗刷，自行晾干或吹风机吹干，或用擦镜头纸轻轻擦拭。 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 训练项目2

29. 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 使用血球计数板对样品酵母菌液进行计数，并计算菌液浓度。 训练项目2 四、内容

30. 微生物细胞数的计数和菌浓的测定 2 制药微生物发酵技术 将微生物计数的结果填入下列空白1.第一次计数的酵母细胞数目＝ 个。2.第二次计数的酵母细胞数目＝ 个。3.从两次的计数结果中求出酵母细胞的平均数目4.稀释倍数＝ 倍。5.求出每毫升酵母菌液中的细胞数＝ 个。 训练项目2 五、报告

31. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 训练项目3 一、项目指导 溶氧系数的测定方法有许多种，概括起来分为三大类，即亚硫酸盐氧化法、动态法和稳态氧平衡法。本实验采用亚硫酸盐氧化法，以Cu2+作为催化剂，溶解在水中的氧能立即氧化其中的亚硫酸根离子，使之成为硫酸根离子。若反应器中装入亚硫酸盐和少量催化剂铜离子(0.5mol/LNa2SO3水溶液，另加10-3mol/L的CuSO4)，同时进行通风搅拌，则反应器中氧的传递和反应过程可表示为：

32. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 训练项目3 在常温下，亚硫酸根离子的氧化反应是很快的，其反应速度远大于氧的溶解速度，所以氧一经溶于液相就立即被氧化(反应液中的氧浓度CL→0)。 这样溶氧速度就成了控制氧化反应的决定因素，通过测定反应液中亚硫酸根离子浓度的变化即可测定出溶氧速度，进一步即可计算出溶氧系数。

33. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 训练项目3 一、材料和用具 • 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液1L 称取25g Na2S2O3·5H2O于500mL烧杯中，加入300mL新煮沸过的冷蒸馏水，待完全溶解后，加入0.2g Na2CO3，然后用新煮沸过的蒸馏水稀释至1000mL，保存于棕色瓶中，在暗处放置，10天左右后标定。 • 2. 0.05mol/L碘标准溶液1L 称取13g碘和25g KI于200mL烧杯中，加少许蒸馏水，搅拌至碘全部溶解后，转入棕色瓶中，加水稀释至1000mL，塞紧，摇匀后放置过夜。

34. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 3. 0.2%淀粉指示剂100mL 称取0.2g可溶性淀粉，用少量水调成糊状，溶于100mL沸水(蒸馏水)中，继续煮沸至溶液透明。冷却，贮于玻璃塞瓶中备用。(新配制) 4. 吸管（2、5、25mL）、酸式滴定管、试管、洗耳球、小漏斗、铁架台、100mL量筒、250mL碘量瓶、5L发酵罐 训练项目3

35. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 训练项目3 二、内容 1.于5L发酵罐中装入0.5mol/L亚硫酸钠溶液3L，罐温调至25℃，加入10-3mol/L硫酸铜溶液50mL，开搅拌搅匀（转速300rpm），待通气量稳定后（通气量10L/min），即可取样。 2.取样前先弃去20mL左右反应液，再用试管正式取样并计时。15min后取第二次样，再过15min后取第三次样。

36. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 3.移取2mL反应液于装有25mL 0.05mol/L碘标准溶液的250mL碘量瓶中，加预先煮沸冷却水50mL，然后用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至淡黄色，再加入0.2%淀粉指示剂5mL，此时溶液呈深蓝色，继续用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色刚好消失。 训练项目3

37. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 训练项目3 三、 分析与记录 OUR=(900ΔV•M)/(V0•t) OUR：耗氧速率（mol/L•h） ΔV：两次取样滴定硫代硫酸钠溶液的体积差(mL） V0：取样分析液体积，V0=2mL M：硫代硫酸钠溶液浓度，M=0.1mol/L t：两次取样间隔时间（s），t=15min×60s/min=900s KLɑ=4.8×103OUR (25℃) KLɑ：液相体积氧传递系数（1/h）

38. 发酵罐的操作维护和亚硫酸盐氧化法测定KLɑ 3 制药微生物发酵技术 训练项目3

39. 制药微生物发酵技术 归纳总结 种子的扩大培养作用； 分光光度计测定菌浓； 血球计数板进行微生物数量计算； 发酵控制预防染菌

40. 制药微生物发酵技术 应知应会 培养（culture）发酵（fermentation）

41. ⒈ 微生物有哪些特点?试举例说明微生物的工业应用。 ⒉ 工业生产中使用的微生物菌种为什么会发生衰退？菌种衰退表现在哪些方面？防止菌种衰退的措施有哪些？ 制药微生物发酵技术 问题与讨论 3.为什么两种不同规格的血球计数板测定同一样品时，其结果是一样的？ 4.使用细胞计数板应注意什么问题? 5.影响亚硫酸盐氧化法测定KLɑ值的因素有哪些？

42. 谢谢！ 谢谢各位专家！ 恳请指导

43. 恳请各位专家指导！ 谢谢！