ANALISI ENZIMATICA

1. ANALISI ENZIMATICA L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: • determinazione dell’ attività catalitica di enzimi • determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi • determinazione della concentrazionedi sostanze mediante reattivi marcati con enzimi

2. ENZIMI • Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze • Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo • Sono caratterizzati da: • elevato potere catalitico • altissima specificità E + S ES E + P

3. Reazione catalizzata DG* Reazione non catalizzata G DG* X Y DG ENZIMI • Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per: • Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 106 a 1012 più veloci di quelle non catalizzate. • Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche • Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti. • L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.

4. coenzima gruppo prostetico (legato covalentemente) ione metallico OLOENZIMA COFATTORI ENZIMATICI • Oloproteine • l’attività dipende soltanto dalla struttura proteica • Eteroproteine: • l’attività richiede uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori • Il cofattore può essere: • un coenzima (NAD+, NADP+, ADP, ATP) • un gruppo prostetico (FMN, FAD) • uno ione metallico (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+) APOENZIMA (Parte proteica)

5. COFATTORI VITAMINE: precursori di coenzimi

6. CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI • Gli enzimi sono suddivisi in sei classi principali a seconda della natura generale delle reazioni catalizzate: • ossidoreduttasi • transferasi • idrolasi • liasi • isomerasi • ligasi Ciascuna classe comprende delle sottoclassi, che a loro volta comprendono delle sotto-sottoclassi • Un enzima ha generalmente: • un nome comune • un nome sistematico • un numero di classificazione

7. NOMENCLATURA

8. UNITÀ DI MISURA • Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina • Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica(o attività enzimatica) • L’attività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.) Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato al minuto in condizioni standardizzate

9. G6125 Glucose  Oxidase Aspergillus nigerType II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen) Synonyms b-D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase GOx G.Od. CAS Number 9001-37-0 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.3.4 EG/EC Number EINECS Properties MDL number MFCD00131182 References Safety Information Analysis Note Protein determined by Biuret method. Caution Some loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice. Linkage This preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate. Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole ofb-D-glucose toD-gluconolactone and H2O2per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O2uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%. storage temp. -20°C foreign activity Catalase£2 Sigma units/mg solid foreign activity amylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 % Merck Merck13, 4473 Hazard Codes Xn Risk Statements 42 Safety Statements 22-45 RTECS RQ8452000

10. P6782 Peroxidase horseradishType VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) 250-330 units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder Synonyms Horseradish peroxidase Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase CAS Number 9003-99-0 Enzyme Commission (EC) Number 1.11.1.7 EG/EC Number 2326686 MDL number MFCD00071339 Description Analysis Note This product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid Linkage Similar to P8375 Packaging Packaged in mg solid Unit Definition One ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0 Analysis Note Using 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed. Analysis Note The RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A403/A275determined at 0.5-1.0 mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity. Unit Definition One unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C.

11. C5421 Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp.buffered aqueous solution 20-60 units/mg protein (biuret) Synonyms Cholesterol: oxygen oxidoreductase CAS Number 9028-76-6 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.3.6 MDL number MFCD00130783 Identifiers Unit Definition One unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization. Physical form Solution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 Description storage temp. -20°C Properties References Literature Smith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977)

12. Glucose  Dehydrogenase Bacillus megateriumBioChemika ~33 units/mg Synonyms b-D-Glucose: NAD[P]+1-oxidoreductase CAS Number 9028-53-9 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.1.47 EG/EC Number 2328369 MDL number MFCD00131181 Miscellaneous NADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmolb-D-glucose to D-glucono-d-lactone per minute at pH 7.6 and 25°C mol wt Mr~120000 storage temp. -20°C Literature A. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990) 49165 Identifiers Description Properties References

13. ISOENZIMI • Gli enzimi non hanno una struttura omogenea Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica, diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale, affinità per substrato e coenzima….. Es. Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)

14. METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI METODI NON SELETTIVI • Metodi elettroforetici • Metodicromatografici • Metodi di elettrofocalizzazione

15. METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI METODI SELETTIVI • Inibizione chimica • Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,… • Inibizione fisica • Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e • lattato deidrogenasi • Inibizione immunologica • Anticorpi • Reattività selettiva verso un substrato • Determinazione di LDH1

16. Infarto miocardico

17. ESEMPIO DI UTILIZZO DIAGNOSTICO DI ISOENZIMI Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta

18. stato di transizione energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata) energia libera stato iniziale cambiamento totale di energia libera durante la reazione energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata) stato finale direzione della reazione ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE E + S ES E + P • L’energia libera di attivazione DG è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione • Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione • Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione • La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione • Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità delle reazioni chimiche

19. ATTIVITÀ ENZIMATICA • L’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata • La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo • La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico-fisiche ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione. Queste equazioni mettono in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti

20. A P A + B P 2 A P CINETICA CHIMICA • Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione che indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti • Reazioni di ordine 0 • La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti • Reazioni di 1° ordine • Reazioni di 2° ordine

21. A P E A P velocità [substrato] CINETICA ENZIMATICA • In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta • In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso • Il grafico velocità-concentrazione è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo • dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili, • mentre V e Km sono due costanti vmax

22. k1k2 E + S ES E + P k-1 EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN • L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità-concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten • Come già detto, Vmax è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi Vmax = k2[ES] • Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui Vmax = k2[E] • L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima

23. CINETICA ENZIMATICA 3 1° ordine 2 [ s ] × × [ E ] [ s ] V [ s ] > > = v = k max K 2 m K K m m 1 • Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato • Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni Regione 1 La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

24. CINETICA ENZIMATICA V V  v  max max 2 3 2 [ [ s s ] ] ordine 0 > > K m 1 intermedie ordine misto = = v [ E ] V k max 2 Regione 2 Regione non utile dal punto di vista analitico Regione 3 Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica

25. DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE [P] 1 2 tempo • La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ iniziale della reazione (v0) o (vi) • Vantaggi: • Si misura sicuramente la Vmax • L’enzima è in buone condizioni • Non ci sono problemi di inibizione da prodotto • Possibilità di distinguere tra attività enzimatiche diverse • Metodi analitici rapidi

26. DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE Segnale analitico (s/T) Approccio dispendioso in termini di tempo Si utilizzano metodi ad un punto, a due punti, multipunto s t tempo

27. [P] tempo DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE • Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla • Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau • Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo • Inconvenienti: • difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura) • tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse

28. METODI AD UN PUNTO DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE • Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo l’inizio della reazione • Si risale all’attività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione • Affinchè la misura sia accurata: • il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo • ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura segnale Sx tx tempo • La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo l’inizio della reazione. In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo

29. METODI AD UN PUNTO DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE Approccio tecnico Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi ad un punto • Metodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici • Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore) • Metodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici • Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione. Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema

30. METODI A DUE PUNTI DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo l’inizio della reazione Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema Affinchè la misura sia accurata: • ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t1 e t2 ai quali viene eseguita la misura segnale S2 Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché l’attività enzimatica viene calcolata come DS / Dt S1 t1 t2 tempo

31. METODI A DUE PUNTI DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE Approccio tecnico Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi a due punti • Metodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici • Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura • A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale • Metodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici • La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa • Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure

32. ENZIMI IN DIAGNOSTICA • Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma • Aumento del turnover cellulare • Proliferazione cellulare (neoplasia) • Aumento di sintesi enzimatica (induzione) • Lesione di un tessuto • Ostruzione della secrezione • Diminuzione della eliminazione (clearance) • Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da: • sintesi dell’enzima • stato d’integrità delle membrane cellulari • fenomeni di distribuzione • velocità di eliminazione

33. Alcuni enzimi del plasma

34. colinesterasi tripsina attività enzimatica relativa 6 8 10 6 8 10 papaina pepsina 4 6 8 2 4 6 pH EFFETTO DEL pH Il profilo a campana è il più comune

35. attività enzimatica relativa 20 40 60 T (°C) EFFETTO DELLA TEMPERATURA • Gli enzimi hanno diversa stabilità termica • La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica

36. E S P MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE Reazioni enzimatiche semplici • Condizioni sperimentali • Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso • pH e Temperatura controllati rigorosamente • Attenzione alla inibizione da substrato

37. Eprim. Eind. S P1 P2 k1 k2 Eprim. Eaus. Eind. S P1 P3 P2 MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Reazioni enzimatiche accoppiate • Altre condizioni peculiari • La reazione primaria deve essere l’unico fattore limitante • Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione primaria, perché se P1 non viene rimosso rapidamente • può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria • può seguire una via metabolica diversa • Per misure di almeno il 96% dell’attività enzimatica primaria k2 / k1≥ 100 • Condizioni sperimentali • Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso • pH e Temperatura controllati rigorosamente

38. DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI • Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come “strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse con i seguenti vantaggi: • L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione • L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione Maggiore rapidità Maggiore accuratezza Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici Risparmio di reagenti

39. CINETICA ENZIMATICA 3 1° ordine 2 [ s ] × × [ E ] [ s ] V [ s ] > > = v = k max K 2 m K K m m 1 • Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato • Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni Regione 1 La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

40. LDH Eind. Acido lattico + NAD+Acido piruvico + NADH + H+ S P METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI • Per spostare la reazione dall’equilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano • Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica • Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione (idrazina) • Le condizioni sperimentali (enzima indicatore in eccesso, pH e T ottimali) non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente • Esempio: acido lattico

41. Eaus. Eind. S P1 P2 METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI • Condizioni sperimentali • Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso • pH e Temperatura ottimali • La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato

42. METODI DI MISURA • La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse • Tali proprietà devono poter essere misurabili • I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono: • spettrofotometrici • luminometrici • Altri metodi sono: • potenziometrici, conduttometrici, polarografici • Ci sono, inoltre, metodi basati su enzimi immobilizzati

43. METODI SPETTROFOTOMETRICI I metodi spettrofotometrici sono quelli maggiormente utilizzati e si basano su: • Misura diretta • Misura mediante derivati chimici • Misura mediante derivati generati enzimaticamente

44. METODI SPETTROFOTOMETRICI • Misura diretta • Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici) • Esempio: p-nitrofenilfosfato +H2O p-nitrofenolo + fosfato fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p-nitrofenilfosfato, idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a 405 nm (giallo) • Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nell’UV (gruppi ciclici e doppi legami) • Esempio: uricasi rivelata mediante l’assorbimento a 293 nm dell’acido urico che viene trasformato dall’enzima in allantoina • Inconvenienti della misura di assorbimento nell’UV: • lampada a idrogeno per generare l 200-300 nm • cuvette di quarzo costose • proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nell’UV AP

45. Assorbanza Lunghezza d’onda (nm) METODI SPETTROFOTOMETRICI • Misura diretta • L’attività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P)+ • Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm • Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico • Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo

46. N NR2 N NR2 R2N N R3C N+R1 R3C N+ + N CR3 Cl- 2Cl- Rx Ry N N N Sale monotetrazolico Sale ditetrazolico R = gruppi aromatici METODI SPETTROFOTOMETRICI • Misura mediante derivati chimici • Sali di tetrazolio • Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare e

47. Etanolo NAD+ PMSH Sale di tetrazolio Acetaldeide NADH + H+ PMS Prodotto di riduzione (formazano) METODI SPETTROFOTOMETRICI • Misura mediante derivati chimici • Sali di tetrazolio • Esempio: alcol deidrogenasi Alcol deidrogenasi PMS = fenazina metasolfato • Il valore di e dei formazani (e=20 m2/mol) è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H (e=6.3 m2/mol) , perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = ebc)

48. X + NAD(P)H + H+ XH2 + NAD(P)+ YH2 + NAD(P)+ Y + NAD(P)H + H+ 2-Oxoglutarato Alanina Lattato NAD+ Glutammato Piruvato Piruvato NADH + H+ ALT LDH METODI SPETTROFOTOMETRICI • Misura mediante derivati generati enzimaticamente • Accoppiamento con ossidoreduttasi Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH)

49. Glucosio H2O + O2 Prodotto colorato o fotoni Acido gluconico H2O2 Accettore cromogenico o luminogenico Glucosio ossidasi Perossidasi METODI SPETTROFOTOMETRICI • Misura mediante derivati generati enzimaticamente • Accoppiamento con perossidasi Esempio: glucosio ossidasi

50. Fosfolipasi Fosfatidilcolina + 2H2OAcido fosfatidico + Colina Colina ossidasi Colina + 2O2Betaina + 2H2O2 Perossidasi 2H2O2 + AccettoreProdotto colorato + 2H2O + O2 METODI SPETTROFOTOMETRICI • Misura mediante derivati generati enzimaticamente • Accoppiamento con perossidasi Esempio: fosfolipasi