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实验七 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备. 一、 用品. 2ml 注射器，刻度吸管，离心管、吸管、量筒、载玻片 恒温水浴，天平，离心机、显微镜等。. 二、试剂. 秋水仙碱（秋水仙素），生理盐水配制成 0.1%l 浓度 低渗液： 0.075mol/LKCl 。 固定液（ Carnoy 固定液） 甲醇 ∶ 冰乙酸（ 3 ∶ l ），临时配制。 Giemsa 工作液： 1 份原液和 10 份磷酸缓冲液 磷酸缓冲液： 1/15M Na2HPO4 、 1/15M KH2PO4 等体积混和. 三、实验步骤.
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一、用品 2ml注射器，刻度吸管，离心管、吸管、量筒、载玻片 • 恒温水浴，天平，离心机、显微镜等。
二、试剂 • 秋水仙碱（秋水仙素），生理盐水配制成0.1%l浓度 • 低渗液：0.075mol/LKCl。 • 固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制。 • Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液 • 磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和
三、实验步骤 • 秋水仙素处理:取材前2~3小时,向小鼠腹腔注射0.1%秋水仙碱溶液(5~8ug/g小鼠体重)。 • 取骨髓细胞:将小鼠断颈处死后，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，用75%酒精棉球檫去残余肌肉碎渣，剪开股骨一端，用注射器吸取37度预温的生理盐水，插入剪开的股骨小孔，反复将骨髓细胞冲出，直至骨髓腔呈白色为止。 • 收集细胞：将悬液全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8—10分钟，弃上清液。
4. 低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗25—30分钟。 5.预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8—10分钟。 6.固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。 7.制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
8．滴片：取预先冰冻的洁净的载玻片，甩掉冰水后迅速吸取细胞悬液自10—20cm高滴在一张载玻片上，轻吹散，将载玻片掠过酒精灯几次，以助染色体的分散和展开，气干。8．滴片：取预先冰冻的洁净的载玻片，甩掉冰水后迅速吸取细胞悬液自10—20cm高滴在一张载玻片上，轻吹散，将载玻片掠过酒精灯几次，以助染色体的分散和展开，气干。 • 9．染色：1:10 Giemsa染色5—10分钟，细水洗去多余染液，气干。 • 10镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
四、注意事项 • 1．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。 • 2．低渗使细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。
3．离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失3．离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失 • 4．固定液应在使用前临时配制 • 5.载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
五、作业 • 挑选分散良好的染色体标本，计数染色体数，如实验失败试分析原因。 • 实验报告
