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分子克隆经验交流

分子克隆经验交流. 071202. 准备好了吗？. 你知道自己所做实验的前前后后吗？ 准备好持久作战了吗？ “ 没有失败就不会进步 ” 好奇与肯干并行 有没有整理的习惯？ 自己的资源：文献、笔记、思路及实验系统（ PCR 体系、连接体系等） 公用的资源： 敢于大胆讨论？. 交流的范围：让目的基因在 E.coli 中表达. 第一部分：目的片段了解有多少. 目的片段？. 文献：中文期刊网、万方、 pubmed 、 http://scholar.google.com/schhp?hl=zh-CN 等 “ 关键词 ” 有所选择的看；

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分子克隆经验交流

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Presentation Transcript

  1. 分子克隆经验交流 071202

  2. 准备好了吗？ • 你知道自己所做实验的前前后后吗？ • 准备好持久作战了吗？ • “没有失败就不会进步” • 好奇与肯干并行 • 有没有整理的习惯？ • 自己的资源：文献、笔记、思路及实验系统（PCR体系、连接体系等） • 公用的资源： • 敢于大胆讨论？

  3. 交流的范围：让目的基因在E.coli中表达

  4. 第一部分：目的片段了解有多少

  5. 目的片段？ • 文献：中文期刊网、万方、pubmed、http://scholar.google.com/schhp?hl=zh-CN等 • “关键词” • 有所选择的看； • 好的文献要在实验中不断的看，反复的看。 • 专利：中国专利局、patenthunter、http://www.google.com/patents等

  6. 对你的片段了解有多少？ • 影响因素： • 核酸：GC含量、里面有什么样的酶切位点 • 蛋白：亲疏水性（膜蛋白很难表达）、大小（5~100KD）、Cys（二硫键） • 工具： • DNAStar软件包中：EditSeq可以分析GC含量，蛋白大小，Protean可以分析蛋白的亲疏水性。 • Oligo可以查找内切酶位点。 • 在线预测一些信号肽预测等。

  7. 引物设计（克隆引物） • 考虑的因素：长度、Tm值、Loop值、要不要终止密码等； • 设计之前一定要分析序列自身的酶切位点； • 是否通过T载体——决定是否要保护碱基； • 设计时考虑通用性——酶切位点的选择； • 引物合成最好是分两管； • 公司合成的引物可能会出错或没有分装！ • 有些时候可以将错就错 • 要不要突变引物 • 直接扩增获取小片段

  8. BamH I与Bgl II同尾酶 • BamH I：GGATCC • Bgl II ：AGATCT • T载体的正插与反插

  9. 突变引物的设计 • 主要考虑引物3‘端加T（或A）

  10. PCR扩增 • 要有一个稳定的PCR系统（Buffer、dNTP、Taq等最好分装） • 普通大小的片段用rTaq即可，但突变是完全可能的。 • 循环数不用太多。 • 扩增时最好加石蜡油。 • PCR最怕污染了！！！！ • 突变PCR最好测一下序。

  11. 连接T载及转化 • 如果有设计保护碱基此步可省； • Takara体系效率很高； • 转化： • Amp抗性失效问题：菌在平板上长久了会分泌酰胺酶降解Amp，产生卫星菌落。 • 酶切过程要分析T载上的酶切位点及片段自身酶切位点，分析正反插。 • Buffer选择。 • 双酶切切载体时，最好先用一种酶切完后用另一种。

  12. 第二部分：做进表达载体

  13. 表达载体 • 非融合表达： • 融合表达 • 辅助表达：CKS等 • 辅助构象折叠及二硫键形成：TRX、MBP、GST、NusA等 • 纯化：Pet、GST等 • 其他载体（分泌表达、可溶性表达等）

  14. 整框和非整框； • 标签：可多标签； • 对现有载体进行改进：

  15. 表达不出来，怎么了？ • 重新分析序列，是否有终止密码（非常用密码子）、设计不整框、引物出错等； • 重新完成一遍，耐心的； • 调节表达条件：改变温度、IPTG、抗性的量、培养基（Tryphone含有微量乳糖） • 更换载体： • 更换表达菌株： • 换人做做，不行暂时放弃吧！

  16. 表达菌株

  17. 谢谢！！

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