第四章柠檬酸发酵机制

第四章柠檬酸发酵机制 • 重点：了解柠檬酸生物合成的基本原理，掌握其发酵调控手段。

柠檬酸生物合成途径 • 葡萄糖 • ↓① • 6-磷酸葡萄糖 • ↓② • 1,6-二磷酸果糖→磷酸二羟丙酮→甘油 • ↓③ • 丙酮酸 →– CO2→乙酰CoA ↘ • ↙↘ ↘+ CO2 →草酰乙酸↗柠檬酸 • 乙醛,乳酸 • 关键酶: ①己糖激酶, ②磷酸果糖激酶，③丙酮酸激酶. • 注:乙酰CoA+草酰乙酸→柠檬酸,进入三羧酸循环

柠檬酸代谢调控 • 氧化磷酸化可产生9个ATP. • 理论转化率106.7% • 1、磷酸果糖激酶(PFK)是调节酶，受ATP和柠檬酸的抑制,而被AMP,无机磷和NH4 +激活.这表明了 NH4 +能有效解除柠檬酸对PFK的抑制，而大量积累柠檬酸. • 2、柠檬酸合成酶, 受ATP抑制,而在菌种细胞中，ATP主要以络合物ATP-Mg的形式存在,其抑制作用较弱.而草酰乙酸可激活此酶(通过提高此酶与乙酰CoA的亲和力实现).

3、丙酮酸羧化酶 （1）也称线粒体酶，是组成酶，有四个亚基与四分子生物素连接。（2）生物素辅基在酶的位点上起中间载体的作用将羧基转移到丙酮酸上生成草酰乙酸。（3）K+对该酶有激活作用 • 4、丙酮酸脱H酶（1）受ATP和亚砷酸的抑制。（2）ADP、Ca+ 使该酶激活。

柠檬酸合成简要途径 丙酮酸 + CO2 ↙ ↘ – CO2↗ ↓丙酮酸羧化酶 ↓ 丙酮酸脱H酶草酰乙酸乙酰CoA ↘ ↙柠檬酸合成酶柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸(三羧酸循环) • 5、柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸的反应，是因为黑曲霉的线粒体上存在顺乌头酸水合酶,它能催化建立以下平衡:柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7，该酶需要Fe2+参与，应控制Fe2+浓度。而NAD-异柠檬酸脱氢酶活性低,虽然细胞质中NADP-异柠檬酸脱氢酶不受柠檬酸抑制,但在线粒体上的NADP-异柠檬酸脱氢酶受柠檬酸抑制;所以当柠檬酸达到一定浓度时，能够抑制自身的进一步分解,导致积累柠檬酸; 当pH到2.0时,已经能使上述三种酶失活而进一步积累柠檬酸.

以黑曲霉生产柠檬酸时，如果短时间停止供气，会影响柠檬酸的产量，但对菌体生长没影响。这主要是黑曲霉含有两条呼吸链，即侧系呼吸链（不生成ATP）和标准呼吸链（生成ATP）。当供气正常时，两条呼吸链同时工作，代谢正常进行。当供气不正常时，侧系呼吸链产生不可逆失活，此时NADH2只能通过标准呼吸链氧化，产生过量的ATP，从而抑制磷酸果糖激酶(PFK)的活性，糖酵解减慢。以黑曲霉生产柠檬酸时，如果短时间停止供气，会影响柠檬酸的产量，但对菌体生长没影响。这主要是黑曲霉含有两条呼吸链，即侧系呼吸链（不生成ATP）和标准呼吸链（生成ATP）。当供气正常时，两条呼吸链同时工作，代谢正常进行。当供气不正常时，侧系呼吸链产生不可逆失活，此时NADH2只能通过标准呼吸链氧化，产生过量的ATP，从而抑制磷酸果糖激酶(PFK)的活性，糖酵解减慢。

黑曲霉柠檬酸发酵机制小结 • 锰缺乏(<30mmol) →抑制蛋白质合成→NH4 +浓度上升(25mmol 左右)解除柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制. • 不产ATP的侧系呼吸链→解除对磷酸果糖激酶的抑制→EMP途径顺畅。 • 应降低Fe2+浓度来抑制顺乌头酸水合酶的话性. • 降低pH值有利于积累柠檬酸.

利用假丝酵母生产柠檬酸 • 大约在1963年左右发现一些棒状杆菌能够利用正烷烃为碳源生产谷氨酸，同时日本也研究开发了假丝酵母利用正烷烃为碳源生产柠檬酸的项目。 • 主要特点： • 发酵初期只长菌不长菌，只有在培养基中的氮源消耗完以后才开始积累柠檬酸。 • 发酵pH不低于5.0。 • 高Fe2+浓度会增加乌头酸水合酶的活性，减少柠檬酸的积累。 • 产物中异柠檬酸比例的较高，达到50%，可添加抑制剂（氮氟乙酸、2,4-二硝基苯酚等）抑制乌头酸水合酶活性。

第四章 柠檬酸发酵机制