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DNA 的 复 制 DNA replication. 一、 DNA 复制假说. Watson 和 Crick 提出的 DNA 复制方式为半保留复制方式;. 全保留复制:亲代 DNA 分子完整的转移到子代中;. 散布式复制:亲代 DNA 片段分散在子代 DNA 分子中。. Meselson - Stahl 实验.

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DNA 的 复 制 DNA replication


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    Presentation Transcript
    1. DNA 的 复 制 DNA replication

    2. 一、DNA 复制假说 Watson和Crick提出的DNA复制方式为半保留复制方式; 全保留复制:亲代DNA分子完整的转移到子代中; 散布式复制:亲代DNA片段分散在子代DNA分子中。

    3. Meselson-Stahl实验 1958年, Meselson和Stahl首先将大肠杆菌在含重同位素15N的培养基中培养约十五代,使所有细菌都被15N标记。然后移至只含有轻同位素14N的培养基中同步培养一代,二代,三代。分别提取DNA,作CsCl密度梯度离心,观察DNA的位置。

    4. 混合 123 15N-DNA 14N-DNA

    5. 对15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性,对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。对15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性,对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。 结果变性前的杂交分子为一条中间密度带,变性后则分为两条区带,即重密度带(15NDNA)和低密度带(14NDNA)。

    6. *1963年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且DNA是环状分子。*1963年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且DNA是环状分子。 *1957年Taylor用3H脱氧胸苷的溶液标记蚕豆,证明了真核生物染色体的复制也是以半保留复制方式进行的。 ●DNA分子是以半保留凡是进行复制,不管是原核还 是真核生物。

    7. 二、半保留复制 1、定义 DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代DNA,每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链,这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。

    8. 模板 • 原则 • 特点 • 亲代的DNA双链,每股链都可作为模板 • 按碱基配对原则指导新链的合成 • 合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样 • 一条链来自于亲代的DNA链,另一条链是新合成的链 规律

    9. 亲代DNA 子代 子代 新合成 的链 半保留复制

    10. 2、DNA半保留复制的类型 1)线性双链: 双向、多重起始双向

    11. θ型双向 2) 环状DNA:θ型(双向、单向)、 D型、滚筒

    12. 滚筒复制

    13. φX174RF是一个合成单链病毒圆环的模板

    14. D型复制

    15. 1)底物:四种脱氧核糖核酸: 即dATP,dGTP,dCTP,dTTP 3、参与DNA复制的物质 2)模板: 亲代DNA链作为模板。 3)引物: RNA作为引物(primer) ;原核生物:通常为50~ 100个核苷酸、真核生物:约为10个核苷酸; 其顺序与其模板DNA的碱基顺序相配对

    16. 4)DNA聚合酶(DNA Polymerase): • 以dNTP为前体催化合成DNA • 需要模板和引物的存在 • 不能起始合成新的DNA链 • 催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-OH末端 • 催化DNA合成的方向是5'→3'

    17. Kornberg酶(1956年) • 400个酶分子/每个细胞 • 单链多肽(109kD) • 大小二个片段(枯草杆菌蛋白酶处理) DNA聚合酶Ⅰ(DNA PolymeraseⅠ, PolⅠ) • DNA聚合酶有三种 • 具有多种酶活性的多功能酶 • 参与DNA复制的主要是polⅢ和polⅠ。 A原核生物聚合酶

    18. 5’ 3’ 外切酶 3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶 聚合酶 N C 小片段 大片段( klenow片段) (常用的工具酶) 76kD 34kD

    19. 5‘-3’聚合活性: ♦模板; ♦3‘-OH末端引物; ♦ 方向从5’-3‘。

    20. 切除错配核苷酸 错配硷基 正确 核苷酸 复制方向 3´ 5´ 3´ 3´ 5´ DNA聚合酶Ⅰ的校对功能(3’-5’ 外切酶活性)

    21. 5’-3‘外切酶活性: ♦ 从5’-P端依次切除,可连续切除多个核苷酸; ♦ 只切配对的5’-P末端核苷酸; ♦ 既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸; ♦ 对只有5’末端的切口也有活性。

    22. DNA聚合酶Ⅰ的5‘-3’外切酶活性和聚合活性同时作用可进行切口翻译,制造放射性探针。DNA聚合酶Ⅰ的5‘-3’外切酶活性和聚合活性同时作用可进行切口翻译,制造放射性探针。

    23. MW为120KD • 100个酶分子/每个细胞 • 聚合作用:只有DNApolⅠ的5% • 3’→5’外切酶活性 • 无5'→3'外切酶活性 • 对作用底物的选择性较强 • 不是复制的主要聚合酶 DNA聚合酶Ⅱ(DNA Polymerase Ⅱ, Pol Ⅱ)

    24. pol Ⅲ由十种共22个亚基组成 • α亚基具有5’→3’聚合DNA的酶活性 • ε亚基具有3’→5’外切酶的活性 • θ亚基具有促进ε亚基外切酶的活性 DNA聚合酶Ⅲ(DNA Polymerase Ⅲ, Pol Ⅲ)

    25. 在复制叉处为一二聚体 • 核心酶(core enzyme):α、ε、θ。α:聚合作用;ε:3’-5’外切;θ:与亚基结合有关; • γ、δ、δ’、χ、ψ提高反应速率和持续性; • β:使DNApol能结合在DNA上。β亚基结合于DNA时消耗ATP;如同一个夹子,使DNApolⅢ结合于DNA。 • τ:使两个DNApol单体形成二聚体,分别在复制叉的两个链上作用。

    26. B真核生物聚合酶 五种 • DNA聚合酶α • DNA聚合酶δ和PCNA • DNA聚合酶γ • DNA聚合酶β、ε 功能: • 参与随从链的合成 • 参与前导链的合成 • 参与线粒体DNA的合成 • 参与DNA的修复

    27. 真核细胞几种主要DNA聚合酶的性质 DNA聚合酶 α β γ δ ε 蛋白质分子量(KD > 250 36-38 160-300 170 256 细胞定位 核 核 线粒体 核 核 5’ →3’聚合酶 有 有 有 有 有 3’ →5’外切酶 无 无 有 有 有 引物酶 有 无 无 无 无

    28. 5)解链酶(unwinding enzyme/ helicase )

    29. 6) 引物酶(Primase) ♦本质:依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP) Ecoli:60kD,DnaG 编码 ♦ 引发体(primosome):引物酶+引发前体(蛋白 因子i、n、n”、dnaC、n’、dnaB)

    30. 3 DnaC Helicase(DnaB) primosome 3´ 5´ primase

    31. 蛋白因子i、n、n”与蛋白dnaC跟引物预合成有关;蛋白因子i、n、n”与蛋白dnaC跟引物预合成有关; • 蛋白因子n’和蛋白dnaB与识别复制起始点有关,并具有ATPase活性。

    32. 7)单链结合蛋白 • single strand binding protein, SSB • 能够与单链DNA结合的蛋白质因子 • 稳定单链DNA,不形成发夹结构 • 保护单链DNA,不受DNA水解酶作用 • 可重复使用,在滞后链上不断摆动,冈崎片段合成

    33. TOPO酶:切割DNA链,使其松弛后再连接。 不需ATP,切割双链DNA中的一链,使DNA松弛后, 连接切口。 ♦TOPOⅠ: 切割DNA双链,此时不需ATP;尔后由ATP供能,使DNA分子成负超螺旋再连接切口。 ♦TOPOⅡ: 8) 拓扑异构酶(topoisomerase): 可使DNA拓扑异构体互变的酶。

    34. 功能:与DNA形成共价结合中间体,使DNA磷酸二酯 键断裂,形成DNAnick,DNA的一条链进行解 旋旋转改变DNA分子的拓扑结构。 参与复制、转录、重组。 ♦ 效应:可使DNA发生:连环化(catenate)、脱连环化 (decatenate)、打结(knot)、解结(unknot)。

    35. 拓扑异构酶Ⅰ:MW=100kD,单肽链,含3-4个Zn 作用: • 每次改变一个连环数; • 结合DNA,使该处溶解; • 形成酶-DNA复合物; • 切割双链中的一股,使DNA中的一股链穿越切割点; • 断裂单链连接

    36. 拓扑异构酶Ⅰ作用机理示意图

    37. 拓扑异构酶Ⅱ:又称旋转酶。 广泛存在于各种生物中。 作用: • 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。

    38. 拓扑异构酶Ⅱ的作用机制