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实验三 ELISA 检测溶血素

实验三 ELISA 检测溶血素. 【 试剂与器材 】. 绵羊红细胞（ SRBC ）免疫小鼠血清 抗 SRBC 阳性和阴性血清 辣根过氧化物酶（ HRP ）标记的抗甲胎蛋白抗体 碳酸盐缓冲液（ PH9.6 ） 磷酸盐缓冲液（ PBS ， PH7.4 ） 邻笨二胺液 硫酸（ 2M ） 酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。. 【 试剂与器材 】. 包被稀释液（ 0.05mol/L Na2CO3 — NaHCO3 缓冲液， PH9.6 ） Na2CO3 1.5g NaHCO3 2.9g 加双蒸水至 1000ml

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实验三 ELISA 检测溶血素

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  1. 实验三 ELISA检测溶血素

  2. 【试剂与器材】 • 绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清 • 抗SRBC阳性和阴性血清 • 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗甲胎蛋白抗体 • 碳酸盐缓冲液（PH9.6） • 磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4） • 邻笨二胺液 • 硫酸（2M） • 酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。

  3. 【试剂与器材】 • 包被稀释液（0.05mol/L Na2CO3—NaHCO3 缓冲液，PH9.6） Na2CO3 1.5g NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml • 封闭液（5%小牛血清/PBS 溶液） 小牛血清50ml PBS（PH7.4）950ml • 洗涤液（PBST，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml

  4. 【试剂与器材】 • 样本稀释液（PBS，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 加双蒸水至1000ml • 酶标第二抗体：羊抗人IgG 标记HRP（1：2000）

  5. 【试剂与器材】 • 底物液（OPD—H2O2） A 液 （0.1mol/L 柠檬酸溶液） 柠檬酸19.2g 加双蒸水至1000ml B 液 （0.2mol/L Na2HPO4 溶液） Na2HPO4.12H2O 71.7g 加双蒸水1000ml 临用前取A 液24.3ml，B 液25.7ml • 终止液（2mol/LH2SO4 溶液） 双蒸水600ml，浓硫酸100ml（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至900ml

  6. 【操作方法】 （1）包被酶标反应板 • 用pH9.6 的碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗体，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml， 4°C 12~24h。 （2）封闭酶标反应板 • 弃掉包被液，用PBS 洗涤3 次，甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭。放37°C40min（或4°C 过夜）。封闭结束后用洗涤液洗板，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。

  7. ELISA平板包被 间接法 • 抗原包被: 将包被液稀释的抗原（SRBC）BSA （2-10ug/ml）加入96孔酶标版中，每孔100ul，4C过夜。吸出上清液，加入封闭液200ul/孔。37C封闭1-1.5小时或4C过夜。封闭结束后用洗涤液洗板3次，每次3分钟。

  8. 【操作方法】 （3）按图1-11 所示加入待测样品及阳性对照（用PBS 稀释） • 将稀释好的待测血清样品加入酶标反应板中，每孔0.2ml，阳性对照样品亦相应稀释。置于37°C 温箱0.5~1h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3 遍，每遍3min。 （4）加酶标二抗 （用PBS 稀释） • 加入辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋抗体，每孔0.2ml 置于37°C 温箱，30~45 min。弃去孔中液体，拍干，每孔洗涤3 遍，每遍3min。

  9. 【操作方法】 （5）加入底物液 • 取底物液：A 液24.3ml，B 液25.7ml，加双蒸水50ml 得pH5.0 的磷酸—枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30% H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100μl。避光室温作用5~10min。 （6）终止反应 • 当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl 终止反应。

  10. 【结果分析】 目测：根据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（++）为黄色，（+ + +）为棕黄色表示。一般呈+ +以上者为阳性 酶标仪测定：在492nm 波长下测OD 值（A492） 。 • 当待测样品A492值与阴性对照A492值的比值（P/N）大于2.1时，或待测样品A492>对照A492值 ‾ +3s，即可判断为阳性。以最大显色至阳性显色孔的50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。 x

  11. 【注意事项】 1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。 2.加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。 3.每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分钟。 4.洗涤后板要甩干，不要残留液体。

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