Organizzazione generale del genoma umano

1. Organizzazione generale del genoma umano • Lezione n.4

2. Laboratori consorziati all’HUGO nel mondo

3. Punti chiave:HumanGenomeProject • Creare la mappa fisica dei 24 cromosomi umani (22 autosomi, X & Y) • Identificare l’intero set di geni e mapparli sui rispettivi cromosomi • Determinare la sequenza nucleotidica dei 3 miliardi di basi che si ritiene costituiscano il genoma umano • Analizzare la variazione genetica tra individui umani • Mappare e sequenziare il genoms di organismi modello

4. Come hanno fatto: • DNA da 5 individui • 2 maschi, 3 femmine • 2 caucasici, uno asiatico, africano, ispanico • Taglio del DNA con enzimi di restrizione • Ligation in vettori BACs & YACs • Sequenziamento • Un “supercomputer” allinea le sequenze

5. DNA Cut segments inserted into BACs Lots of overlap Known sequence Il sequenziamento shotgun di un genoma utiizza la sovrapposizine delle sequenze per il successivo allineamento

6. Sequenziamento GenMol Di Leonardo2008

8. Human Genome Project Genetic Discrimination • Tutte le malattie hanno una o più componenti genetiche • Tutti gli individui sono dunque a rischio di contrarre malattie determinate da alterazioni genetiche • Questa affermazione implica che non esistono basi scientifiche per la discriminazione genetica dato che tutti apparteniamo allo stesso ‘risk pool’ • Con il sequenziamento del genoma umano abbiamo le informazioni per identificare la predisposizione genetica a malattie ‘genetiche’complesse come il cancro, patologie cardiovascolari, diabete malattie neurologiche/ psichiatriche etc

9. Completamento Genoma Umano • Sequenza lineare di DNA sui Cromosomi. L’intero genoma contiene da • Enorme sforzo tecnologico pubblico e privato • Molto ‘rumore’ non un vantaggio immediato • Il sequenziamento del Genoma Umano promette una grande mole di informazioni biologiche • comprensione del profilo genetico dell’ individuo “Medicina personalizzata” • Individuazione precoce dei fattori di rischio • Molte patologie hanno una componente genetica • - Cancro (30%), malattie cardiache (30%), Diabete , disordini neurodegenerativi, malattie mentali • - L’identificazione dei geni coinvolti potrebbe suggerire nuove terapie (anche a livello genetico) o essere d’aiuto per la diagnosi precoce

10. Da cosa è costituito il genoma umano? Unknown: 42% Cell biology: 29% Gene regulation: 14% Metabolism: 10% Human genome content From Venter et al (2001) Science 291, 1304-1351 Also see Lander et al (2001) Nature 409, 860-921

11. Organizzazione del genoma umano

12. Individuazione di geni “Patologici” (1981-2000) Al 2000 sono stati identificati 1112 geni responsabili di patologie, in parentesi sono indicati geni polimorfici responsabili dell’acquisizione alla suscettibilità ad alcune patologie.

13. Patologie caratterizzate a livello molecolare (1981-2000) Al 2000 sono state caratterizate 1430 patologie a livello molecolare. Dal computo sono escluse circa 150 neoplasie causate da fusione genica a seguito di traslocazioni cromosomiche.

14. Modelli Animali Sperimentali • L’analisi del genoma di organismi diversi ha messo in luce una alta conservazione nella funzione di diversi prodotti genici • La possibilità di produrre animali “transgenici” che portano specifiche mutazioni, o complementi di mutazioni in diversi geni • Utilizzazione: • Studio della relazione esistente tra genotico e fenotipo (dissezione molecolare) • Screening a tappeto di nuove sostanze farmacologicamente attive • Produzione di organi e tessuti compatibili

15. Organizzazione del genoma umano COMPLESSITA’ -Geni interrotti -Presenza di geni sovrapposti -Meccanismi di splicing alternativo

16. Organizzazione del genoma umano

17. Organizzazione del genoma umano

18. Organizzazione del genoma umano

20. Organizzazione del genoma umano

21. Organizzazione del genoma umano

22. I geni non sono uniformemente distribuiti nei cromosomi La distribuzione genica nel genoma umano (e in altri mammiferi) non è uniforme. -Zone ricche e zono a bassa densità genica. -le zone ricche di geni sono in prossimità dei telomeri (ricche GC>48%) -zone povere di geni sono ai centromeri. Ad esempio il cr.21 e il 22 sono simili in dimensioni. Ma mentre il 21 contiene circa 220 geni il 22 ne contiene 550.

23. Organizzazione dei geni umani

24. Organizzazione dei geni umani con funzioni affini -Molti geni umani sono in unica copia e in un unico locus distinti da altri geni. -Altri sono membri di famiglie geniche che sono sorte per eventi di duplicazione di geni originariamente in singola copia. Solitamente con funzioni simili. -I geni umani presentano una enorme variabilità per dimensioni e organizzazione interna. -Alcuni geni hanno dimensioni enormi e richiedono tempi lunghi per trascrizione (es. gene distrofina umano richiede 16 ore, Tennyson et al.)

26. Polimorfismi del DNA • Polimorfismi, mutazioni e metodi per evidenziarli

27. Polimorfismi del DNA

31. Polimorfismi del DNA: microsatelliti Minisatelliti (VNTR) Unità fino a 5 bp. Segmenti lunghi fino a 25 kb Allele ATACCAAGGTACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG Allele B TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG Microsatelliti (STR) Unità < 4bp. Segmenti lunghi fino150 bp Allele A TACCAAGGTACACACACGGTACCATGG Allele B TACCAAGGTACACACACACGGTACCATGG Allele C TACCAAGGTACACACACACACGGTACCATGG Allele D TACCAAGGTACACACACACACACGGTACCATGG

34. Come evidenziare i polimorfismi? RFLP= restriction fragment length polymorphism

35. Minisatellite VNTR Gli RFLP possono evidenziare sia polimorfismi dovuti a mutazione di singoli nucleotidi (che fanno comparire o scomparire siti di restrizione) sia polimorfismi di tipo minisatellite (VNTR = Variable Number of Tandem Repeats)

36. Microsatellite STR I polimorfismi di tipo microsatellite possono essere evidenziati mediante PCR (STR = Short Tandem Repeat) Due vantaggi principali rispetto agli RFLP: più facili da evidenziare (PCR), e molto più polimorfici (elevato tasso di eterozigosità).

37. I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR) sono stati estremamente utili per ottenere una prima mappa globale del genoma umano

38. La mappa genetica ottenuta con i marcatori è fondamentale per mappare i geni responsabili di patologie umane (positional cloning) Madre Padre Malati Malato con marcatore assente Il gene causa della patologia è associato a un marcatore RFLP nella madre malata e nel 75% della progenie esaminata. Questo permette di mappare il gene su quel cromosoma. La posizione di un gene malattia viene definita valutando la frequenza di ricombinazione del carattere fenotipico rispetto ai marcatori polimorfici disponibili.

39. Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi Amplificazione della regione mediante PCR con oligonucleotidi fiancheggianti il punto di interesse e successiva digestione con enzimi di restrizione. Anemia falciforme Una mutazione p.tiforme Porta alla perdita di un sito di taglio per l’enzima MstII , il malato presenterà una banda più pesante, mentre il portatore 2 bande.

40. Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici b A b S P1 P1 P2 P2 PCR

41. Polimorfismi del DNA: SNP (single nucleotide polymorfism) Sono polimorfismi a singolo nucleotide, molto utili e informativi grazie alla loro abbondanza nel genoma. ---ATGTTGAAGTTCAAGAATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGTATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGCATTCTGTGCGGAAC--- ---ATGTTGAAGTTCAAGGATTCTGTGCGGAAC---

42. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Soggetto eterozigote C/T

44. Applicazioni pratiche dell’utilità dei polimorfismi -Test genetici (paternità, forensi, etc…) -Analisi geni coinvolti in patologie -Analisi filogenetiche -Studio di aplotipi (HAPMAp Project) Alcuni esempi…

50. Ladder Indagato 12 6 9 8 10 10 Vittima 12 8 9 8 Tamp vagin. 9 8 8 12 8 10 12 6 9 10 6 9 12 10 8 10