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短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 胞内物质分离鉴定及SOD基因克隆表达

短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 胞内物质分离鉴定及SOD基因克隆表达. 研 究 生：马桂美 导 师：刘 波 博士、研究员 关 雄 博士、教 授 车建美 博士、副研究员. 福建农林大学、福建省农业科学院 2013年5月30日. 主要内容. 一. 二. 三. 四. 五. 六. 研究背景与意义. 技术路线. 研究内容. 结论与展望. 发表论文. 致谢. 一、研究背景与意义. 菌体：菌体杆状、革兰氏阳性、产芽孢、周生鞭毛、菌体约为 0.8μm-2.2μm ；

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短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 胞内物质分离鉴定及SOD基因克隆表达

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  1. 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内物质分离鉴定及SOD基因克隆表达短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内物质分离鉴定及SOD基因克隆表达 研 究 生：马桂美 导 师：刘 波 博士、研究员 关 雄 博士、教 授 车建美 博士、副研究员 福建农林大学、福建省农业科学院 2013年5月30日

  2. 主要内容 一 二 三 四 五 六 研究背景与意义 技术路线 研究内容 结论与展望 发表论文 致谢

  3. 一、研究背景与意义 菌体：菌体杆状、革兰氏阳性、产芽孢、周生鞭毛、菌体约为0.8μm-2.2μm； 菌落：NA培养基上，菌落浅黄色、无光泽、不透明、电镜下菌落呈放射状褶皱。 电镜形态 菌落形态 菌体形态 1、短短芽胞杆菌形态学特性

  4. 一、研究背景与意义 2、短短芽胞杆菌基因组研究 Asia Europe 短短芽胞杆菌NBRC100599 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX • 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX：序列总长6Mb,预测得到5666个基因,GC含量47.30% • 短短芽胞杆菌NBRC100599：序列总长6.3Mb,预测得到6121个基因,GC含量47.30%

  5. bdb基因 aldB基因 α-乙酰乳酸脱羧酶的基因 二硫化物氧化还原酶基因 已研究的 部分基因 tycA、tycB、tycC xylB基因 细胞壁蛋白合成基因 Add Your Text 短杆菌酪肽合成酶基因 木聚糖酶基因 一、研究背景与意义 3、部分功能基因研究现状

  6. 一、研究背景与意义 4、短短芽胞杆菌应用 • 人类表皮生长因子（Ukara S.,1976) • 植物的α-淀粉酶（ Takagi H et.al.,1989） • 产气夹膜杆菌的α-毒素（Masahiro Nagahama et.al.,1996） • 石油开采（郭万奎等，2007） 蛋白表达受体 工业生产 生物防治 环境治理 • 防治白菜灰霉病菌（S.G. Edwards et.al.，2001） • 抑制重金属吸收，促生长（A.Vivas et.al.，2006） • 防治青枯雷尔氏菌（易有金等，2007） • 防治棉花立枯病、枯萎病（陈莉等，2008） • 降解苯酚（V.Arutchelvan et.al.，2006） • 降解六氯甲烷（Archna Gupta et.al.,2000）

  7. 一、研究背景与意义 5、本实验室相关的研究现状 • 筛选得到短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX • 菌株的鉴定 • 生物学特性研究 • 具有抑菌保鲜功能 www.themegallery.com

  8. 一、研究背景与意义 5、本实验室相关的研究现状-短短芽胞杆菌胞外物质的分析 羟苯乙酯 邻苯二甲酸二丁酯 FJAT-0809-GLX 邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯 硫酸链霉素 清水对照

  9. 一、研究背景与意义 6、胞内物质分析研究现状 • 胞内物质包括脂溶性和大分子物质； • 脂溶性物质经有机溶剂萃取，GC-MS进行分析。 • 大分子物质主要为有活性的蛋白类物质，主要采用分子克隆表达方法进行分析研究。 单品 GC-MS分析 发酵生产 克隆 表达

  10. 一、研究背景与意义 6、胞内物质分析研究现状 短短芽胞杆菌 胞内物质分析 暂无文献可考 超声波细胞破碎 微生物与植物细胞胞内物质提取方法 微波细胞破碎 有机溶剂萃取 反复冻融

  11. 一、研究背景与意义 6、胞内物质分析研究现状 • SOD普遍存在于动物、植物和微生物中； • 作用：清除体内多余自由基； • 优点：无毒、无副作用； • 用途：作为食品、化妆品、保健品添加剂，医学中也有应用，SOD在植物中的过量表达可提高植株环境耐受力。

  12. 一、研究背景与意义 研究意义 • 短短芽胞杆菌胞内物质研究尚未见报道，胞内物质种类丰富，可分离得到活性物质，以此拓宽短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX应用范围。 • 短短芽胞杆菌SOD酶为胞内蛋白，不易获得，采用原核克隆表达技术，将其基因导入大肠杆菌，并在其细胞内进行蛋白表达，为SOD酶大规模生产提供可能，该方法体系的建立为短短芽胞杆菌其他功能基因研究和应用奠定基础。

  13. 短短芽胞杆菌FJA7-0809-GLX 胞内物质分析 胞内脂溶性物质分析 分子生物学方法研究胞内蛋白 条件优化 有机溶剂萃取 SOD基因克隆与表达 气质色谱鉴定 蛋白理化性质分析 蛋白表达条件优化 获得胞内活性物质 二、技术路线

  14. 三、研究内容 1 2 3 4 胞内物质提取条件的响应面法优化 胞内物质分离鉴定 SOD基因的克隆与表达 SOD原核表达条件优化

  15. 三、研究内容 1、胞内物质提取条件的响应面法优化 （2） 超声波细胞破碎单因素条件摸索 超声时间 料液比 超声功率

  16. 三、研究内容 1、胞内物质提取条件的响应面法优化 （3）响应面的试验 • 二次多项回归方程如下：Y=11.30-1.33A-1.52B-1.86C-4.85A2-3.20B-0.34C-0.89AB+4.05AC+3.29BC • 方差分析显示：R2=0.9724,即该模型拟合程度较好，可用于之后响应面的研究。

  17. 超声时间与料液比等高线与立体分析图 超声时间与超声波功率等高线与立体分析图 料液比与超声波功率等高线与立体分析图 三、研究内容 1、胞内物质提取条件的响应面法优化 （3）响应面的试验 • 料液比与超声波功率的交互作用明显。 • 超声时间与料液比的交互作用显著。 • 超声时间与超声波功率的交互作用较小，可忽略。

  18. 三、研究内容 1、胞内物质提取条件的响应面法优化 （3）响应面的试验 • 设置胞内物质提取条件 • 获得最优胞内物质提取条件 • 最优条件是：超声功率318.78 w，超声时间14.64 min，料液比为0.04，得率为15.7527。

  19. 三、研究内容 2、胞内物质分析 • 不同提取条件，物质种类和含量都会有所差异，如超声波功率为100w时，匹配率高于95%的仅有7种，而超声功率为500w时，有20 种。而超声功率500 w，超声40min时获得物质种类最多—25种，并获得抗氧剂1076，出峰时间为45.729，峰面积达到13.65。

  20. 割胶回收 SOD基因PCR扩增 三、研究内容 3、SOD基因的克隆与表达 （1）SOD基因PCR扩增及割胶回收 • 以基因组为模版扩增SOD基因 • PCR产物经割胶回收，去除PCR产物中的杂质，用于基因克隆

  21. 3000 bp-- 1000 bp-- 500 bp-- 三、研究内容 3、SOD基因的克隆与表达 （2）阳性克隆子验证 ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTCGCGGATCCATGGCACATCAACTTCCTGCATTGCCTTATGCACACAACGCTTTGGAACCACATATCGACGCGCAAACCATGGAAATCTATCACGGACGCCACCATGCTACTTATGTTAACAACCTGAATGCAGCTCTGGAAGCACACGCTGACCTGCAAGGTAAAGGCGTTGAAGAGCTGATCAGCAATCTGGATGCTCTGCCTGAGTCCATCCGCACTGCTGTTCGCAACAACGGTGGAGGCCATGCTAACCACACACTGTTCTGGGAAATCATGAGCCCGAATGGCGGCGGTGCACCAACTGGTGAACTGGCTGACGCAATCAACGCGGCTTTCGGAAGCTTTGACAACTTCAAAGCAGAATTCGCAAAAGCAGCTACTACTCGTTTCGGTTCCGGATGGGCTTGGCTGACTGCAGAAGGCGGAAAAGTAGCAATCAGCTCTACGCCTAACCAAGACAGCCCAATCATGGAAGGTAAAACACCTATCCTTGGTCAGGATGTTTGGGAGCATGCATACTACCTGAACTACCAAAACAAACGCCCCGACTACATCGGTGCGTTCTGGAACGTAGTAAACTGGGATGAAGTTAGCAAGCGTTTCGCAGCAGCGAAGTAACTCGAGCGGAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTC • 随机挑选2株阳性克隆子和2株对照，通用引物分别进行菌落PCR验证，阳性克隆子获得750 bp片段，对照菌株获得650 bp片段，初步判断已成功克隆得到SOD基因 • 阳性克隆子测序结果显示，SOD基因克隆较完整 • 在线比对结果显示，相似度为99%，仅个别碱基发生了错配 阳性克隆子 对照

  22. 三、研究内容 3、SOD基因的克隆与表达 （3）SOD基因在线比对及理化分析 • SOD基因在线比对结果显示，仅第98个碱基发生错配 • SOD蛋白序列在线比对相似度100%，个别碱基的错配不影响蛋白翻译。 • SOD由202个氨基酸构成，其分子量约为22 kD unnamed protein product Length=202 Score = 416 bits (1070), Expect = 6e-154, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 202/202 (100%), Positives = 202/202 (100%), Gaps = 0/202 (0%) Query 1 MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISN 60 MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISN Sbjct 1 MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISN 60 Query 61 LDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFA 120 LDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFA Sbjct 61 LDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFA 120 Query 121 KAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPD 180 KAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPD Sbjct 121 KAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPD 180 Query 181 YIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAK 202 YIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAK Sbjct 181 YIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAK 202 MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISNLDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFAKAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPDYIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAK 阳性克隆子与原始菌株的SOD蛋白质一级结构比对

  23. 疏水性分析 信号肽预测 二级结构分析 三、研究内容 3、SOD基因的克隆与表达 （3）SOD基因在线比对及理化分析 • 等电点pI为5.71，其最大疏水值1.267，最低疏水值-2.956，无信号肽序列。 • ScanProsite 分析显示，其为MnSOD，具有锰离子和铁离子结合区。 • 二级结构分析显示，该蛋白有两个保守区。

  24. 阳性转化子 重组质粒 双酶切验证 PCR验证 三、研究内容 3、SOD基因的克隆与表达 （4）pET/SOD重组质粒构建和重组载体的获得 • 经验证后的SOD基因重组至pET-28a质粒上，热激转化至DH-5α中，获得重组质粒，经PCR验证和双酶切验证可知，已成功获得重组质粒 • 提取重组质粒，热激转化至BL-21中，获得阳性转化子。 重组质粒

  25. 胞内SOD 胞外SOD 对照 22kD 22 Kd 三、研究内容 3、SOD基因的克隆与表达 （5）SOD蛋白诱导表达 • 软件预测可知SOD蛋白分子质量为22 kD，诱导表达后经SDS-PAGE电泳也获得约22 kD的蛋白，即短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX中的SOD酶基因在大肠杆菌BL-21中顺利表达； • 菌体及菌液上清中均含有SOD蛋白，即SOD蛋白进行了可溶性表达。 25KD-

  26. 诱导前菌体浓度影响 IPTG影响 温度的影响 三、研究内容 4、SOD蛋白表达条件优化 （1）单因素条件优化 • 酶比活折线图显示：诱导温度10 ℃时菌液中酶比活最高；IPTG浓度为0.5 mmol/L时，菌液中酶比活最高；诱导前菌体OD600为0.8时菌液中酶比活最高。 • 对菌体中酶比活影响较小。 诱导前菌体浓度影响

  27. Mn离子影响 Fe离子影响 诱导时间影响 三、研究内容 4、SOD蛋白表达条件优化 （1）单因素条件优化 • 酶比活折线图显示：Fe离子浓度为1.5 mmol/L时菌液中酶比活最高；Mn离子浓度为1.0 mmol/L时，菌液中酶比活最高；诱导时间为12 h菌液中酶比活最高。 • 对菌体中酶比活影响较小。

  28. 三、研究内容 4、SOD蛋白表达条件优化 （2）最陡爬坡实验 • 以单因素实验结果为基础，选择各因素实验水平，采用Mintab软件分析试验数据 • Mn离子浓度对其比活影响较显著； • 诱导时间和诱导前菌体浓度影响显著； • 诱导温度对比活影响较小； • IPTG浓度对比活影响呈负相关。

  29. 三、研究内容 4、SOD蛋白表达条件优化 （3）响应面优化 二次多项回归方程如下：　　　Y=-4112.07731+3089.23125A+3835.58900B+4448.55700C-1667.73594A2-1580.65100B2-2482.00100C2+1507.88750AB-2525.27500AC+1650.22000BC • 各因素对酶比活影响大小如下：IPTG浓度>Mn离子浓度>诱导前菌体浓度

  30. Mn离子浓度与IPTG浓度交互作用 诱导前菌体浓度与Mn离子浓度交互作用 诱导前菌体浓度与IPTG浓度交互作用 三、研究内容 4、SOD蛋白表达条件优化 （3）响应面优化 • 诱导前菌体浓度与Mn离子浓度交互作用不显著，诱导前菌体浓度与IPTG浓度交互作用显著，Mn离子浓度与IPTG浓度交互作用显著。 • 最优诱导条件：诱导前菌体浓度为0.68，Mn离子浓度为1.65，IPTG浓度0.84，并且得到理论预测值，其值为3761.68 U/mg。

  31. 四、结论与展望 1.建立了短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX细胞破碎方法。采用有机溶剂萃取胞内物质，GC-MS分析显示，超声功率500 w、超声破碎条件为40 min时，获得物质种类最多，并获得抗氧剂1076，其为塑料工业中不可或缺的抗氧剂，目前抗氧剂主要采用化学合成，流程复杂、收率低等，短短芽胞杆菌中FJAT-0809-GLX中抗氧剂的发现，为其合成提供新途径。 2.首次克隆获得短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX中的SOD基因。基因分析显示其为胞内蛋白，不利于蛋白分离纯化及生产应用。实验结果表明，其可在大肠杆菌中进行可溶性表达，菌液上清中即可分离得到SOD蛋白，为其大规模生产及广泛应用奠定基础。

  32. 马桂美，车建美，刘波，史怀，陈峥. 短短芽胞杆菌功能基因的研究及其应用. 生物技术进展，2012，2（2）：92-97.马桂美，车建美，刘波，史怀，陈峥. 短短芽胞杆菌功能基因的研究及其应用. 生物技术进展，2012，2（2）：92-97. 车建美，马桂美，刘波，郑雪芳，唐建阳. 青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株插入位点的鉴定与分析. 福建农业学报，2012，27（11）：1231-1236. 撰写实验报告70余篇。 五、发表论文

  33. 首先向导师刘波研究员及关雄教授致以崇高的敬意和由衷的感谢！在研究生三年的学习生涯中，导师们的渊博知识、求实作风、严谨态度和大胆创新，让我受益匪浅。首先向导师刘波研究员及关雄教授致以崇高的敬意和由衷的感谢！在研究生三年的学习生涯中，导师们的渊博知识、求实作风、严谨态度和大胆创新，让我受益匪浅。 由衷感谢车建美副研究员在本试验过程中给予的很大帮助。在与车老师讨论过程中，她对试验过程提出了很多建设性的意见，使得论文顺利完成。同时，很感谢唐唯其师兄在本试验过程中给予的帮助。 感谢实验室工作人员朱育菁、蓝江林、阮传清、陈峥、葛慈斌等老师们对试验以及论文写作的指导，他们为论文完成提供了巨大的帮助。感谢林海云、刘国红、陈建力等师兄师姐们的倾囊相授，同时要感谢福建省农业科学院全体同学们的帮助，使得论文顺利完成。 最后，特别感谢我的家人在研究生三年中给予的支持和鼓励。在他们的支持和鼓励下，让我得以顺利走完这三年学习生涯。 六、致谢

  34. 谢谢

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